天花粉蛋白抗单纯疱疹病毒1型的实验研究

检测用基因工程方法制备的天花粉蛋白抗单纯疱疹病毒1型的活性。将单纯疱疹病毒1型在细胞系中培养．加入天花粉蛋白后,观察细胞病变情况,用酶联免疫吸附（ELISA）的方法检测病毒生长情况。结果显示,加入天花粉蛋白的细胞始终未见细胞病变,ELISA检测为阴性;阴性对照组细胞在第3d以后均出现单纯疱疹病毒1型感染典型细胞病变．ELISA检测结果为阳性;阳性对照组始终未见单纯疱疹病毒1型感染典型细胞病变,ELISA检测结果为阴性。天花粉蛋白在体外培养细胞系中可以抑制单纯疱疹病毒1型。     

乙型肝炎病毒蛋白及COX-2在乙肝相关性肝细胞癌发展与转移中的作用机制

目的探讨乙型肝炎病毒蛋白及环氧合酶-2(COX-2)在乙肝相关性肝细胞癌发展与转移中的作用机制.方法取42例慢性乙肝患者行穿刺活检时乙型肝炎病毒ccc DNA为阳性乙肝相关性肝细胞癌组织;另取同期手术切除的11例ccc DNA为阴性的非乙型肝炎相关性肝癌组织.免疫组化法检测乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2、CD34的表达水平,Werdner法计算微血管密度;分析上述因子与乙肝相关性肝细胞癌组织微血管生成的相关性.RT-PCR和Western blot检测人肝癌细胞系(HepG2)和稳定转染乙型肝炎病毒X蛋白(HepG2-X)细胞中COX-2mRNA和蛋白表达情况;ELISA法检测细胞上清液中PGE2表达水平和不同浓度COX-2抑制剂塞来昔布作用后PGE2水平.结果乙型肝炎病毒X蛋白阳性表达组织中COX-2阳性率明显高于乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织和非乙型肝炎相关性肝癌组织(P0.01).乙型肝炎病毒X蛋白阳性表达组织中早期癌症微血管密度明显低于进展期癌症组织,乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织中微血管密度明显低于阳性表达组织(P0.01);COX-2阳性表达组织中微血管密度明显高于COX-2阴性表达组织(P0.01);非乙型肝炎相关性肝癌组织中微血管密度明显低于乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2阳性表达组织(P0.01),与乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织和COX-2阴性表达组织之间差异无统计学意义(P0.05);乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在乙型肝炎相关性人肝细胞癌组织微血管生成呈正相关.HepG2-X细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达水平明显高于空载体对照HepG2细胞,并且细胞培养上清液中PGE2水平明显增加;与HepG2细胞相比,塞来昔布对HepG2-X细胞分泌PGE2具有更强的抑制作用.结论乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在乙肝相关性肝细胞癌组织中高表达,促进了癌组织微血管生成;乙型肝炎病毒X蛋白可通过COX-2/PEG2信号通路促进了肝癌的发生和发展.     

人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系.     

双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶在宫颈病变组织和癌细胞中的表达

目的探讨双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1b(DYRK1b)在宫颈病变组织和癌细胞中的表达情况及其作用.方法选取宫颈癌患者127例为研究组,同期确诊为慢性宫颈炎患者32例为对照组,收集上述患者石蜡组织标本,免疫组化SP法检测DYRK1b蛋白表达情况.依据宫颈癌细胞系He La 229和Si Ha细胞将标本分为实验组(加DYRK1b抑制剂Az191)、对照组(不加Az191),Western blod法检测细胞中DYRK1蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果子宫颈鳞癌阳性表达率明显高于慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮内病变、高级别鳞状上皮内病变,差异均具有统计学意义(P0.01);高级别鳞状上皮内病变明显高于慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮内病变,差异具有统计学意义(P0.05).在He La 229和Si Ha细胞中,DYRK1b蛋白表达量随Az191剂量增加而减少,且均明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.01).研究组He La 229和Si Ha细胞抑制率随Az191浓度增加而提升,均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05).10μmol/L的Az191作用后,研究组He La 229和Si Ha细胞凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05).结论宫颈病变过程中DYRK1b蛋白表达水平逐渐提升,宫颈癌组织和细胞中均呈高表达;下调DYRK1b蛋白表达后可抑制宫颈癌细胞增殖,促进凋亡.     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

天花粉蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的制备及鉴定

将小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0细胞）与经TCS免疫过的小鼠脾细胞融合,融合后的细胞悬浮于HAT培养液中进行选择性培养,挑选可以分泌TCS单克隆抗体的细胞系,再经克隆化为单克隆细胞系。用间接酶联免疫吸附法检测此细胞系分泌单克隆抗体情况。经细胞融合和2次克隆化后,获得1株可以稳定分泌TCS单克隆抗体杂交瘤细胞系,ELISA检测结果为阳性。获得了可以稳定分泌天花粉蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为TCS鉴定、应用奠定良好的基础。     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.     

梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。     

异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的肾小球系膜细胞活性的影响

目的探讨异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的人肾小球系膜细胞HRMC活性的影响及相关机制.方法将体外培养的HRMC细胞分为正常对照组、高糖模型组、Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、异黄芪皂苷Ⅳ低、中、高浓度组,培养48 h.CCK-8法测定细胞增殖能力;酶联免疫吸附法测定上清液中Ⅳ型胶原含量; DCFH-DA测定活性氧含量; Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4、瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)表达.结果与高糖模型组比较,随着异黄芪皂苷Ⅳ浓度的增加,给药组的HRMC增殖水平依次降低,差异具有统计学意义(P0.05),Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组的HRMC增殖水平明显低于高糖模型组,差异具有统计学意义(P0.05);与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的Ⅳ型胶原含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05),其中,异黄芪皂苷Ⅳ呈剂量依赖性降低HRMC上清液中Ⅳ型胶原表达;与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的细胞活性氧含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05),其中,异黄芪皂苷Ⅳ呈剂量依赖性降低细胞活性氧含量;与高糖模型组比较,Tempol阳性对照组、Ly364947阳性对照组、各浓度异黄芪皂苷Ⅳ干预组的TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表达水平均明显下降,TRPC6蛋白表达水平明显上升,差异具有统计学意义(P0.05).结论异黄芪皂苷Ⅳ对高糖诱导的HRMC损伤具有保护作用,其机制与抑制细胞增殖、降低活性氧生成、下调TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表达、上调TRPC6表达有关.     

结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立

建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系. 在阳离子脂质体作用下,将HSP65-hIL-2真核表达质粒转染与BALB/c 遗传背景一致的P815细胞(H-2d).G418筛选阳性克隆,RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的蛋白的转录和表达. 阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65-hIL-2融合基因特异性的mRNA表达;用鼠抗人的IL-2 mAb进行间接免疫荧光检测,可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光,而未转染细胞则为阴性.成功获得稳定表达HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染细胞系,为其疫苗的CTL研究提供了合适的靶细胞.     

反式激活HIV-1 LTR的HHV-6基因片段B701的缺失研究

ＨＨＶ－６在体外可以激活ＨＩＶＬＴＲ引导的基因表达［１］，其基因组中一基因片段Ｂ７０１已被证明与这种激活作用有关［２］．Ｂ７０１编码１４３个氨基酸的蛋白质，可与ＨＨＶ－６基因组中其它基因片段协同作用提高对ＨＩＶＬＴＲ的激活效力．对Ｂ７０１进行缺失突变，得到突变体ＲＳＶ－Ｂ７０１－ｄ１（３′端缺失１８１个ｂｐ）、ＲＳＶ－Ｂ７０１－ｄ６（３′端缺失３５３个ｂｐ），将这两个缺失突变体分别与ＨＩＶ－Ｌｕｃ共转染受体细胞，通过ＬＵＣ活性分析发现，缺失突变体ｄ１、ｄ６不但仍具有激活能力，而且ｄ６的激活能力要远远大于ｄ１．二级结构预测初步揭示了Ｂ７０１对ＨＩＶ－ＬＴＲ的反式激活作用机制，为阐明ＨＨＶ－６基因产物与ＡＩＤＳ的病理关系提供了依据．     

天花粉蛋白结构改造对引产活性的影响

目的：研究结构改造对天花粉蛋白（ＴＣＳ）引产活性的影响。方法：利用定点突变将ＴＣＳ第２１９位的天冬酰胺残基改变为半胱氨酸残基（Ｑ２１９Ｃ）以供定点聚乙二醇（ＰＥＧ）修饰,测定修饰产物的致本失活活性及小鼠中期引产活性。结果：ＰＥＧ修饰使的致核糖体失活活性约降低９０％;相对分子质量为５０００的ＰＥＧ修饰对引产活性无明显影响,而相对分子质量为２００００的ＰＥＧ修饰却明显增强引产活性;此外,ＰＥＧ修饰使Ｔ     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。     

用杆状病毒表达系统表达的HIV-2 gp105和gp36的反应原性与抗原特异性分析

用ELISA方法分析由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达的HIV-2外膜蛋白gp105和跨膜蛋白gp36的反应原性和特异性. 结果表明, 二者均具有很好的反应原性和抗原特异性, 可作为免疫抗原和检测抗原加以应用.     

天花粉蛋白诱发人体免疫抑制中DQA1和DQB1等位基因的顺式互补受邻近DQ基因的调变

人类白细胞抗原HLA－DQ等位基因DQA1*0501和DQB1*0201以顺式和反式两种互补格局决定中药提取物天花粉蛋白诱发人体免疫抑制中CDS介导型性状的表达．研究工作进一步揭示其中的顺式互补受另一单元型上DQB1等位基因的调变．其中起正向调变作用的等位基因是DQB1*0302，0303，0401，0601；发挥负向调变作用的等位基因是DQB1*0201，0501，0602．以上现象表明天花粉蛋白诱发人体免疫应答的遗传控制呈现十分复杂的格局．     

HIV-specific cytotoxic T lymphocytes in seropositive individuals

Virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) which kill virus-infected cells are thought to be a major host defence against viral infections. Here we report the existence of human immunodeficiency virus (HIV)-specific CTL in persons infected with this virus, the aetiological agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Recombinant HIV-vaccinia viruses were used to express HIV antigens in B-cell lines established from subjects seropositive for HIV and seronegative controls. Circulating lymphocytes capable of killing HIV env-expressing autologous B cells were detected in eight of eight seropositive subjects; in addition, at least three seropositive subjects demonstrated gag-specific cytotoxic responses. No HIV-specific cytotoxicity was observed in seronegative subjects. Selective inhibition of the env-specific cytotoxicity by a CD3-specific monoclonal antibody indicates that the effectors are T cells. This demonstration of a cytotoxic T-cell immune response to HIV in infected individuals should prove useful in investigating the immunopathogenesis of HIV infection further and in evaluating AIDS vaccine strategies.     

Effect of immunization with a vaccinia-HIV env recombinant on HIV infection of chimpanzees

Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by human immunodeficiency virus (HIV) and is now recognized as a worldwide epidemic for which there is no cure or vaccine. Chimpanzees are the only other animals that can be infected by HIV, and therefore the chimpanzee-HIV model system is useful for testing potential HIV vaccines. However, with one exception, there have been no reports of clinical manifestations of AIDS in chimpanzees. We report here results of an HIV vaccine trial in which nine chimpanzees were first immunized with either a recombinant vaccinia virus expressing the envelope glycoproteins of HIV strain LAV-1 (v-env5) or a control recombinant vaccinia virus and were then challenged with a high or low dose of LAV-1. Although HIV-specific antibody and T-cell responses were elicited by immunization, virus was isolated from lymphocytes of all challenged chimpanzees, indicating that immunization did not prevent infection by HIV. Among the animals that received a higher dose of LAV-1, one of two control chimpanzees, but none of the four v-env5-immunized chimpanzees developed substantial and persistent lymphadenopathy.