Pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆达和纯化

用PCR扩增嗜高温菌Pyrococctu furiosus的小分子热休克蛋白基因后,克隆于质粒pT7473中.该小分子热休克蛋白Pfu-sHSP含有较多的稀有密码子,在大肠杆菌BL21(DE),几乎无表达,而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA(arg)AGG(arg),AUA(ile)和CUA(leu)的BL21-Codonplus(DE)3-RIL中能大量表迭.大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后,离心沉淀用85℃水浴20 min,再离心,上清液再以Q Sepha-rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化,可以得到90%以上的蛋白.     

关于小分子热休克蛋白Hsp16.3各功能区作用的初步研究

小分子热休克蛋白Hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了Hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌中分别克隆、表达和纯化了N端区或C端区缺失的两个Hsp16.3残体蛋白.远紫外和近紫外圆二色谱分析结果显示,残体蛋白表现出与野生型蛋白相似的二级和三级结构.在九聚体野生型蛋白进行亚基重组装时,C端缺失的Hsp16.3残体蛋白能与野生型蛋白发生相互作用,形成异源寡聚体.在对野生型蛋白进行胰酶消化时,Hsp16.3的α-crystallin域对胰酶的消化具有抵抗能力.所有这些结果显示:在Hsp16.3的3个功能区中,α-crystallin域是一个相对独立和稳定的结构单元,它对该蛋白各级结构的维持十分重要.     

过表达番茄叶绿体小分子热激蛋白提高植株的耐热性

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系．我们将由CaMV35S启动子驱动的叶绿体小分子热激蛋白cDNA导入番茄,Northern及Western印迹分析表明,叶绿体小分子热激蛋白在转基因番茄中呈现组成型表达,通过测定转基因番茄和未转基因番茄的耐热性,发现转基因株系基础耐热性强于对照,说明叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植株的基础耐热性．     

小分子热激蛋白LEHSP23.8在番茄花药与子房中的表达

本实验研究了正常发育温度和热胁迫温度下,番茄花药和子房中线粒体小分子热激蛋白LEHSP23.8的表达,揭示了线粒体定位的sHSP在花药和子房中的组成性表达特征.研究结果还表明,当热激温度略高于西粉三号番茄花粉粒正常发育的最高临界温度时,LEHSP23.8在花药和子房中的表达明显增强.本文讨论了这些生理现象的可能起因,以及花药和子房中组成性表达的sHSP的生物学意义.     

组成型表达线粒体小分子热激蛋白提高番茄抗冷性

线粒体小分子热激蛋白不但是线粒体的主要热诱导产物,而且也被低温诱导,线粒体小分子热激蛋白可以提高植物的耐热性,但目前还不清楚它是否与植物的耐冷性有关．本实验利用基因工程方法,将番茄线粒体小分子热激蛋白基因（LeHsp23．8）导入番茄,Northern—blotting及Western—blotting分析结果表明,在35sCaMV启动子的驱动下,导入的线粒体小分子热激蛋白基因呈现组成型表达．转基因番茄呈现耐低温性更强的表型,说明组成型表达线粒体小分子热激蛋白基因能提高番茄的抗冷性．     

热休克蛋白的研究进展

在不利的环境中,各种有机体都有其共同对应的分子反应,即正常基因的表达抑制和一组特殊基因——热休克基因的激活和表达,导致热休克蛋白的大量产生,热休克蛋白主要作为分子伴侣而参与蛋白质的折叠、转运及组装等过程,能恢复或加速清除细胞内已变性的蛋白质而稳定细胞结构,细胞产生热耐受。随着对热休克蛋白研究的不断深入,在生物工程和医学等方面的应用前景十分广阔。     

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白 原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.     

过表达内质网小分子热激蛋白提高拟南芥的衣霉素抗性

内质网小分子热激蛋白是热激蛋白家族成员,具有分子伴侣活性.当植物受到内质网胁迫(ER-stress)时,内质网小分子热激蛋白具有缓解内质网胁迫的功能.我们将CaMV35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因AtHSP22.0导入拟南芥,Northern-blotting印迹分析表明,内质网小分子热激蛋白在转基因拟南芥中呈现组成型表达.转基因株系衣霉素抗性强于对照,说明AtHSP22.0的过量表达增强了拟南芥的衣霉素抗性,缓解了ER-stress.     

冷休克蛋白及冷休克反应

冷休克蛋白是从真细菌中发现的，它不仅作为ＲＮＡ分子的伴侣蛋白，同时还与细菌的多个生理过程有着密切的联系，如：对低温的适应、细胞生长的控制、营养胁迫等．冷休克蛋白引起冷休克反应的分子调控发生在转录和翻译两个水平上．     

大肠杆菌分子效伴侣GroEL和GroES蛋白的高效表达、纯化与鉴定

研究分子伴侣对解决蛋白质折叠的理论问题及基因工程包涵体的实际问题是很有用的。本文讨论的是Ｅ．ｃｏｌｉ的分子伴侣－属于ｈｓｐ６０家族的ＧｒｏＥＬ蛋白及其辅助蛋白ＧｒｏＥＳ。重组质粒ｐＧｒｏＥＳＬ含有大肠杆菌的ｇｒｏＥＬ和ｇｒｏＥＳ基因。利用这个表达载体，经摇瓶发酵，ＩＰＴＧ诱导表达大量的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。破菌后，上清经ＤＥ５２—ｃｅｌｕｌｏｓｅ柱层析，硫酸铵分级沉淀，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析，得到纯度分别为８５％和８０％的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示ＧｒｏＥＬ和ＧＳ蛋白亚基的分子量与理论值相符，同时还定到了ＧｒｏＥＬ蛋白的ＡＴＰ水解酶活力。这种纯化方法操作简单，重复性好，并且可同时得到ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。这两种蛋白可进一步用于体外变性蛋白重折叠的研究     

BCG 65KD热休克蛋白的纯化

目的：研究卡介苗（BCG）65KD热休克蛋白的提纯方法。方法：BCG经37℃恒温振荡培养两周,42℃热休克处理2h,培养液经离心、抽滤、盐析沉淀、SDS-PAGE分离、电泳洗脱等步聚纯化。结果：提纯产物经SDS－PAGE分析,其电泳区带在65KD位置,经抑制试验表明具有较高抗原活性结论：流程方法简单、实用,有助于对IDDM的诊断及其深入研究。     

海带热休克蛋白70基因体外原核表达研究

在前期研究克隆得到全长海带HSP70基因的基础上,为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。     

分子伴侣及其作用机理的研究概况

分子伴侣为一类与其他蛋白不稳定构象结合并使之稳定的蛋白质,广泛分布于各种生物体内。本文对分子伴侣的最新研究作一综述。     

热休克转录因子（σ^32）基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ＾３２的编码基因ｒｐｏＨ，并将基克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ＰＵＨＥ中。     

三株弧菌热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

 根据GenBank中同类蛋白序列设计特异PCR引物,从2株创伤弧菌Vibrio vulnificus和1株河弧菌Vibrio fluvialis中扩增出热休克蛋 白70（heat shock protein, hsp70）基因片段。对这3个片段进行克隆、测序和分析的结果表明,3个片段长均为1 911 bp,包含完整的 hsp70 ORF,编码636个氨基酸。它们的氨基酸序列与GenBank中其它物种hsp70的氨基酸序列比较发现,2株创伤弧菌hsp70基因序列 和同种其它菌株的同源性高,达98%以上;而河弧菌的hsp70序列属首次克隆;与多种原核和真核生物的hsp70氨基酸序列一起构建 了系统进化树,结果支持传统的分类结果。     

氯胺酮相关性膀胱炎大鼠逼尿肌热休克蛋白27的表达及其意义

研究热休克蛋白27(HSP27)在氯胺酮诱导膀胱炎大鼠逼尿肌中的表达及临床意义.基于氯胺酮腹腔内注射诱导大鼠膀胱炎模型,选择不同时间通过尿流动力学检测膀胱收缩功能,收集大鼠膀胱组织,常规病理染色观察膀胱粘膜及逼尿肌结构,免疫组化法检测HSP27在逼尿肌中的表达水平.实验后观察结果表明,同对照组相比,实验组尿动力学表现为膀胱收缩频率显著增加及初感膀胱容量明显减小;对照组膀胱组织无明显病理及免疫表达变化,而实验组可观察到不同程度膀胱粘膜充血,炎症细胞浸润,HSP27表达水平的上升,且HSP27表达水平与诱导时间呈正相关.实验结果表明HSP27的表达水平可能与氯胺酮膀胱炎的逼尿肌收缩活动程度相关.     

高通量蛋白表达和纯化

随着全基因组测序技术日新月异的发展,科研人员现在可以很快捷的获得一种生物编码的所有蛋白的信息,这使得我们可以在细胞水平甚至生物体水平上研究蛋白结构、功能和蛋白质间相互作用。众多学科从中获益,从结构生物学、功能基因组学到药物发现等多个领域都将因此而获得长足的发展。     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

微波对K562/MDR细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响

研究微波引起白血病耐药细胞株K562／MDR的凋亡以及对热休克蛋白70表达的影响。使用MTT方法检测细胞存活率，AnnexinV/PI双参数法检测K562／MDR细胞的凋亡率，流式细胞仪检测热休克蛋白70的表达。结果表明，微波可起K562／MDR细胞的凋亡，经0.20,0.60W/cm^2功率密度微波作用20min（保持43℃），37℃培养24h后，细胞凋亡率分别为10％、13．6％，而水浴加热引起的凋亡率仅为3．8％，微波照射影响细胞内热休克蛋白70的表达，在43℃时，0.20,0.60W/cm^2功率密度微波作用20min抑制HSP70的表达，实验说明微波能引起K562／MDR细胞的凋亡，该凋亡与微波引起的热休克蛋白表达的改变可能有联系。     

谷氨酰胺对小鼠脑损伤中热休克蛋白70表达的影响

将45只体质量为21～24 g的雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(I/R)和谷氨酰胺组(Gln),每组15只.采用线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型,取材前对各组小鼠进行神经功能损伤评分,分别使用TTC染色、HE染色、尼氏染色和TUNEL染色检测各组小鼠脑组织梗死体积、病理损伤情况、尼氏体数量和神经元凋亡情况.采用试剂盒检测各种小鼠脑组织中SOD活性和MDA含量,采用qRT-PCR和Western blot检测各组小鼠脑组织中HSP70的表达,探讨谷氨酰胺(Gln)诱导热休克蛋白70(HSP70)的表达及对小鼠大脑损伤的保护作用及其机制.结果显示,Gln处理脑缺血再灌注小鼠后,小鼠神经功能损伤评分明显降低(P<0.01),脑组织梗死体积明显减少(P<0.01),脑组织中HSP70的表达水平显著增加(P<0.001),尼氏体数量增加,脑组织中SOD活性增加(P<0.05),MDA含量减少(P<0.05),TUNEL阳性细胞数比例明显减少(P<0.01).以上结果表明,Gln通过诱导HSP70的表达,可以减少脑组织梗死体积...