改造人干扰素α2b基因在大肠杆菌中获得高效表达的理论方法

按照Ｅ．ｃｏｌｉ甚高表达基因中同义密码子使用,密码子内和密码之间碱基关联的ＥＥＮＳ模式,对人干扰素α２ｂ基因编码区中的同义密码子进行置换,理论上使得人干扰素α２ｂ基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达水平有非常显的提高,在理论上,未改造的人干扰素α２ｂ基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达水平为ＣＡＩ＝０．３２３,ＣＤＩ＝０．５７４,ＣＥＩ＝０．６２９,是较低表达水平的基因,估计实际表达水平在１０～１０＾３ｍｏｌ／ｃｅ     

重组人干扰素α-2b水针、粉针的稳定性及与干扰素标准品的比较研究

研究重组人干扰素α-2b(商品名:安福隆)的稳定性.采用细胞病变法(CPE)检测在4℃贮存条件下放置不同时段的干扰素α-2b水针、粉针和干扰素标准品的抗病毒能力,与标准品比较,评价了水针和粉针的稳定性.结果显示,在4℃的贮存条件下,干扰素α-2b水针和粉针的抗病毒能力基本相同;经两年贮存后,也没有明显地变化,且均比标准品抗病毒能力强.说明干扰素α-2b水针和粉针稳定性均较好,其辅料配方合理,可有效保护干扰素α-2b,减少其降解.     

重组人干扰素α-2b工程菌培养条件的优化研究

对重组人干扰素α-2b工程菌的培养条件、诱导条件进行研究.提高菌体目标蛋白表达量.通过实验条件的优化确定了适合重组人干扰素α-2b表达的诱导温度、诱导时间和诱导收获时间等.改进工艺后,目的蛋白的表达量大大提高,为进一步的下游工艺的开发奠定了基础.     

按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α-2b基因编码区的核苷酸序列,应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段,经互补片段分别退火和连接后,将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中,进行DNA序列分析,分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组.获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α-2b基因.     

比色法测定聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量

建立比色法测定聚乙二醇化干扰素α2b(PEG-IFNα2b)注射液中吐温80含量,并评估聚乙二醇(PEG,分子量:20KD)对该测定方法的影响。     

按大肠杆菌高表达序列设计的入干扰素α—2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α—2b基因编码区的核苷酸序列，应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段，经互补片段分别退火和连接后，将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中，进行DNA序列分析，分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组，获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α—2b基因。     

重组人干扰素α-2b-卡介苗（hIFN—α-2b—BCG）药物敏感性分析

通过BACTECMGITTM960全自动分枝杆菌培养鉴定／药敏仪对重组人干扰素α-2b卡介苗hIFN-α-2b-BCG）菌株进行利福平等10种抗菌药物的敏感性试验,以野生BCG作对照观察药物对重组BCG菌株活性的潜在影响．结果发现：重组人干扰素α-2b-卡介苗在系统感染上对喹酮类的氧氟沙星、环丙沙星敏感,对氨基糖苷类药物的庆大霉素和卡那霉素耐药．在抗结核类药物中,除对吡嗪酰胺耐药外,外利福平等其他几种抗生素均敏感．因尿液回收率高,几乎所有的抗茵药物都对膀胱中的菌株有影响．     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

重组人干扰素α-2b联合盐酸伐昔洛韦片治疗老年人带状疱疹临床疗效观察

目的观察比较重组人干扰素α-2b联合盐酸伐昔洛韦片与单用盐酸伐昔洛韦片治疗老年带状疱疹患者效果。方法将2010-2014年收治的66例带状疱疹患者随机分为观察组和对照组;观察组32例,对照组34例。观察比较两组患者接受治疗前后临床指标、治疗过程中副反应、临床疗效及带状疱疹后遗神经痛发生率等情况。结果 1观察组疗效明显优于对照组(P<0.05)。2治疗后,观察组疼痛评分低于对照组(P<0.05)。3治疗后,两组患者的后遗神经痛发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组人干扰素α-2b联合盐酸伐昔洛韦片治疗老年带状疱疹疗效优于单用盐酸伐昔洛韦片,且未增多药物副反应。但对减少带状疱疹后遗神经痛方面未发现明显效果。     

溶氧反馈-分批补料高密度培养枯草杆菌谷氨酰胺合成酶工程菌

为了建立枯草杆菌谷氨酰胺合成酶基因重组工程菌BL21/pET28b-glnA的高密度培养工艺,首先以摇瓶培养为基础,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、pH值、诱导剂浓度及时间等进行优化,再扩大至BIOTECH-SBG(5 L)自动玻璃发酵罐培养,利用溶氧反馈补料策略进行分批补料,并在培养过程中保持20%～50%的溶解氧,7.0～7.5的pH,以及1.0g/L乳糖诱导12 h,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终细菌干重达到48.1 g/L,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的55%,粗提物酶比活为10.35 U/mg,整个补料过程细菌比生长率稳定的控制在0.1 h-1左右.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

重组大肠杆菌高效表达hbFGF的培养条件

对工程菌hbFGF/BL21(DE3)pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明，接种量（ψ）为5％，当培养液菌体浓度为0.8OD600时，添加0.5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量，30％的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的表达。     

Production of Poly （3—Hydroxybutyrate—co—3—Hydroxyhexanoate） by Aeromonas hydrophila and Recombinant Escherichia coli

Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) 4AK4 produced poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBHHx) with an almost constant 3-hydroxyhexanoate (3HHx) content of 10 % - 15 % from lauric acid and/or soybean oil. Both A. hydrophila 4AK4 and recombinant Escherichia coil (E. coil) JMU193(pBH32) produced PHBHHx with controllable 3HHx content when fed lauric acid and another co-substrate. With glucose or gluconate as the co-substrate, the 3HHx content in the copolyester produced by A. hydrophila 4AK4 was reduced slightly from 12% to 9%. However, the 3HHx content in the copolyester produced by E. coll JMU193 (pBH32) was significantly reduced from 9% to 2% with fructose as the co-substrate. These results show that regulation of 3HHx content in PHBHHx can be achieved using genetically engineered E. coll.     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

重组大肠杆菌发酵生产二倍体质粒的研究

随着基因治疗和基因疫苗的发展,急需大量的非病毒载体质粒DNA.主要对重组大肠杆菌E.coli DH5α发酵生产pUC21二倍体质粒的培养基组分和补料分批培养的葡萄糖流加策略进行了研究.初步确定的培养基组分是以葡萄糖作碳源,酵母粉作氮源,并且添加磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸和微量元素.研究发现溶氧反馈流加是比较好的流加葡萄糖的补料策略,它能把葡萄糖浓度控制在较低的水平,从而避免产生乙酸效应.溶氧反馈流加发酵的最大生物量可达30.84 g/L,质粒pUC21-Dimer的最大产量达96.38 mg/L.该研究为重组大肠杆菌生产二聚体质粒建立了优化工艺,对大规模生产作为基因治疗的多聚体质粒具有指导意义.     

利用细菌血红蛋白提高大肠杆菌基因工程菌几丁质酶基因的表达

将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)插入几丁质酶基因表达质粒中,然后转入大肠杆菌(Escherichia coli)内,研究vgb基因的表达对几丁质酶基因表达和产物分泌的影响．结果表明,在不同的通氧条件下,vgb基因的表达产物均能不同程度地促进细胞的生长,而且发酵上清液的几丁质酶活性也有提高;若溶氧浓度越低,则效果越明显,可比对照提高达12．1％．同时,由于vgb在大肠秆菌的表达,还可进一步促进几丁质酶在大肠杆菌中的分泌。     

重组人成纤维细胞生长因子-8a在大肠杆菌中的可溶性表达

通过低温诱导,成功实现了重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达.进一步研究了温度、IPTC浓度、诱导时长、诱导时期(OD600)、培养基类型这5个因素对重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白可溶性表达的影响,确定了可溶性表达最优化条件.优化表达条件后实现可溶性表达率大干30%.     

不同流加发酵方式对重组枯草芽孢杆菌生产维生素B2的影响

在5 L发酵罐中培养重组枯草芽孢杆菌RH33生产核黄素,该重组菌的染色体上含有多个解除了转录调节的核黄素操纵子．由于过高的初糖浓度导致严重的代谢溢流,因此间歇发酵过程只能得到较低的菌体量和产物产量．分别采用了3种不同的流加培养方式：分批流加、恒速流加和葡萄糖限制流加来减弱代谢溢流并提高核黄素的产量．同间歇培养相比,分批流加培养能微弱提高重组菌的核黄素产量,而恒速流加和葡萄糖限制流加均能显著提高菌体量和核黄素产量．对于恒速流加培养,当流加速率为0．48 mL／min时核黄素产量和菌体量可以分别达到9．8g/L和27．3g/L对于葡萄糖限制流加培养,通过人工控制葡萄糖流加速率使培养基中的葡萄糖浓度为10～2 g/L时,重组菌RH33可以达到最高的核黄素产量和菌体量(分别为12．5g/L和34．7g/L)．在葡萄糖限制流加培养中核黄素产率约为0．06 g(核黄素)／g(葡萄糖),高于其他几种培养方式．