三种生长因子对AS.1563谷氨酸棒杆菌产赖氨酸的影响

本文以ＡＳ．１５６３谷氨酸棒杆菌为生产菌种，通过摇瓶发酵研究了生物素、苏氨酸、蛋氨酸三种生长因子对赖氨酸产量的影响。实验结果表明，三种生长因子用量不同对赖氨酸产量均有明显影响（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。通过正交实验分析，三者在发酵培养基中的最佳用量配合为：苏氨酸５００ｍｇ／Ｌ、蛋氨酸２００ｍｇ／Ｌ、生物素３５０ｍｇ／Ｌ。     

固定化谷氨酸棒杆菌T6-13细胞生产L-谷氨酸

本文比较了海藻酸钙、明胶-戊二醛、聚丙烯酰胺和琼脂包埋法制备固定化细胞的方法。前者较后几种有较大的优越性,是一种较为理想的固定化方法.分析了海藻酸钙法国定化细胞各主要因素对酶活性的影响,确定出制备固定化细胞的最佳条件.观察凝胶珠中细胞及酶活性的变化表明,细胞在凝胶珠中生长良好,有利于谷氨酸生产.固定化细胞发酵谷氨酸的最适 pH 为7. 0～7. 5,最适温度32℃,最适转速140rpm.每批发酵96小时,糖利用率为98%,产酸量达20g/L,比常规游离细胞增加15%.     

利用透明颤菌血红蛋白基因在谷氨酸棒杆菌中的表达提高谷氨酸和谷氨酰胺的产量

为了降低谷氨酰胺(glutamine,Gln)生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 14067中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平.对得到的重组菌和野生菌进行了发酵实验.在溶氧只有5%的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了1.2倍,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了6.5倍,单位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了1.4倍.对比结果显示,含有vgb基因的重组菌比野生菌在细胞生长、谷氨酸和谷氨酰胺合成等方面的能力都有显著提高.     

谷氨酸棒杆菌串联生产氨基酸和有机酸的发酵工艺

为进一步提高谷氨酸棒杆菌在工业生产中的利用效率,根据其好氧环境下可发酵生产氨基酸,厌氧条件下可积累有机酸的特性,建立了好氧、厌氧两阶段生产氨基酸及有机酸的串联发酵工艺。研究表明:在好氧条件下谷氨酸棒杆菌以80 g/L葡萄糖为碳源生产L-鸟氨酸15 g/L,糖酸转化率为18.75%;好氧发酵结束后收集菌体转入厌氧发酵工艺,以40 g/L葡萄糖为碳源,发酵液中积累乳酸19.58 g/L、乙酸1.34 g/L、丁二酸18.37 g/L,综合糖酸转化率达到98.88%。整个串联发酵工艺的实现,有效地利用了生物质资源、降低了生产能耗、减小了环境污染,有助于提高整体的经济效益,同时也为后续利用代谢工程进一步改造谷氨酸棒杆菌,并将其应用于更广泛的氨基酸、有机酸联合生产奠定了基础。     

溶氧对谷氨酸棒杆菌发酵产谷氨酸代谢的影响

分别控制0、5%、30%3种溶氧水平进行谷氨酸分批发酵,考察了3种溶氧水平下谷氨酸棒杆菌发酵的代谢响应。结果表明,随着溶氧降低,发酵液中柠檬酸和α-酮戊二酸的含量降低,三羧酸(TCA)循环还原臂途径中的有机酸含量增加,丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量也有所增加,在溶氧为0时,乳酸和乙酸大量积累。通过分析不同溶氧水平下的相关酶活和胞内氧化还原状态,发现随着溶氧降低,谷氨酸脱氢酶酶活降低,乳酸脱氢酶酶活升高,胞内氧化还原电势升高,它们的共同作用使氧限制条件下发酵的代谢流流向TCA循环的还原臂途径和乳酸合成途径,导致谷氨酸产量下降。     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.     

谷氨酸棒杆菌生物合成L-鸟氨酸的代谢流分析

应用代谢流平衡模型,通过物料衡算和Matlab线性规划的方法得到谷氨酸棒杆菌1009生物合成L-鸟氨酸的代谢流分布与理想代谢流分布.结果表明:在分批培养条件下,生物合成L-鸟氨酸的过程中,有58.6%的C架进入糖酵解途径,41.4%的C架进入戊糖磷酸途径,L-鸟氨酸的产量达到理论最大产率的65.4%;与理论值相比,应降低三羧酸循环的代谢流,同时减少副产物氨基酸和有机酸的生成.     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

谷氨酸棒杆菌GPAT功能基因鉴定与分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰基甘油(TAG)合成过程中的关键酶.以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CG14为研究对象,利用生物信息学预测了Corynebacterium glutamicum ATCC13032编码GPAT的多个候选功能基因,并选择其中之一cg2777基...     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L–异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA(F383V)连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L–异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L–异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L–蛋氨酸、L–赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L–苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

谷氨酸棒杆菌发酵生产1,5–戊二胺的代谢流分析

为了提高糖类的利用效率,加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动,提高尸胺产量,对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析,找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点,并通过改变溶氧及添加辅酶NADPH对关键节点进行验证.结果表明:6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点,增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸,促进碳源向合成尸胺的方向流动,从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%).该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础.     

谷氨酸棒状杆菌发酵色氨酸的工艺研究

为了优化发酵工艺,提高色氨酸产量,本文对发酵培养基的碳氮源、发酵条件、及小试发酵过程控制进行了实验研究。结果表明,最佳发酵培养基为葡萄糖4g/L、胰蛋白胨20g/L,色氨酸产量达0.43g/L;在摇瓶发酵的基础上,进一步在50L发酵罐中进行小试表明,在发酵温度36℃、pH7.0、搅拌速率700r/min的条件下,色氨酸产量达0.45g/L。     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。     

不同发酵条件对枯草芽孢杆菌产多糖的影响

本实验研究了不同碳源、氮源、温度、发酵时间、接种量、种龄、起始pH值等因素对枯草芽孢杆菌(BaciHus subtilis)B1⑥发酵产多糖的影响,并对发酵影响因素进行了优化实验.结果表明,在发酵过程中,玉米和豆粕粉分别是最佳的碳源和氮源.无机盐的最佳水平为:磷酸二氢钾0.15%,磷酸二氢钠0.1%,MnSO4 0.1%、氯化钙0.2%.其他适宜的发酵条件是:发酵时间5天,接种5%,装液量100ml/300ml,起始pH为8.0.     

密执安棒形杆菌密执安亚种菌株分化的研究

１９９４～１９９５年在新疆加工番茄上分离溃疡病标样中，获致病菌株２种，分白色菌株和黄色菌株，经菌体形态学、生理生化特性、致病性测定、病原细菌血清学研究及ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳的细菌全细胞蛋白质图谱等方面的系统研究，两种菌株无明显差异，在致病力上白色菌株强于黄色菌株，两者都归于密执安棒形杆菌密执安工种。此白色菌株的发现在国内属首次报道。     

γ-聚谷氨酸高产菌株的选育和发酵培养基的初步优化

以实验室保藏的一株枯草芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外、亚硝基胍以及60Coγ射线对其进行复合诱变,获得一株γ-聚谷氨酸高产突变株,在基础培养基中产量是出发菌株的3.11倍,并且突变株经过传代10次,发酵能力稳定;通过正交试验对突变株的发酵培养基进行了初步优化,突变株在一组培养基上的γ-聚谷氨酸产量可达到33.81g/L,是优化前的1.11倍。该突变株的摇瓶发酵产量较高,值得深入开发研究。     

L-缬氨酸的发酵工艺条件研究

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CICC20887为生产菌株,采用单因素实验研究了发酵工艺条件对L-缬氨酸产量的影响.结果表明,该菌发酵生产L-缬氨酸的适宜初糖浓度、生物素添加量、VB1添加量、玉米浆添加量分别为90 g/L、80 μg/L、0.20 mg /L、30 g/L,发酵期间,24 h前pH值应控制在6.5～6.7、后48 h应控制在7.0～7.2,温度30～31℃,发酵周期应控制在66～72 h.     

氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响

研究了腺苷合成途径中不同前体氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响。其中谷氨酸对腺苷合成的促进作用最大,能提高产苷30%以上。谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸也能促进腺苷合成,分别提高16%,14%,10%和6%。进一步研究添加谷氨酸后发酵液中NH4 浓度、有机酸浓度和胞内NAD 浓度的变化,发现添加谷氨酸能提供稳定的NH4 供应,并提供重要的代谢中间物α-酮戊二酸。同时,发酵液中乙酸和丙酮酸的浓度比对照低,胞内NAD 浓度较高,糖酵解生成的丙酮酸能顺利地进入TCA循环,从而能为菌体和腺苷合成提供充足的能量和前体,促进腺苷的合成。