重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和鉴定

用PCR将化学合成的人胸腺肽α1基因扩增并克隆到pMD18-T载体中,经过KpnI／SacI酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b中硫氧还蛋白下游．将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Zn—Sepharose亲和层析纯化以及复性处理,从每升菌液中可获得35mg硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白．经凝血因子Xa酶切、Zn—Sepharose亲和层析以及反相高效液相色谱纯化获得3．8mg重组人胸腺肽．小鼠胸腺细胞凋亡实验表明,重组人胸腺肽能显地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡,且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系．     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10     

突变人GM-CSF基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的构建重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的高效表达质粒,将其表达产物用于分离纯化的研究。方法用人外周血单核细胞获得总RNA作为模板和修饰的5′端密码子的引物经RT-PCR反应扩增到人GM-CSF基因,插入温控表达载体pDH构建了突变的hGM-CSF表达质粒,并将在E.coli中获得表达的突变rhGM-CSF包含体8 mol/L脲提取液进一步用离子交换色谱柱分离纯化。结果rhGM-CSF在大肠杆菌表达占菌体总蛋白量的22%,用弱阴离子交换色谱对rhGM-CSF的工程菌表达产物8 mol/L脲提取液直接经35 m in分离纯化,所得产物纯度可达95%,质量回收率可达到60%。结论这表明用离子交换色谱可进行rhGM-CSF的复性与同时纯化。     

重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

人脑钠素(hBNP,humanbrainnatriureticpeptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素.临床研究表明,hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物.化学合成脑钠素全基因,以pET32a为表达载体,构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin＿hBNP)融合蛋白表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25%以上.融合蛋白经肠激酶裂解、Zn＿Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析,从每升培养液中可获取4mgrhBNP,纯度达到95%.经质谱测定,rhBNP样品的分子量为3464Da.体外活性测定结果表明,rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应,其ED50为(2.24±0 58)×10-6mg/mL.     

人IFN-γ在大肠杆菌中高效表达和色谱复性研究

从健康人外周血分离单核细胞，经LPS刺激后提取总RNA，用RT—PCR扩增hIFN-γ的cD—NA。将扩增产物克隆后进行序列分析证明，克隆的hIFN-γcDNA除存在2个序列多态性位点外，与天然的干扰素氨基酸序列完全一致。利用温控表达系统在大肠杆菌中实现了hIFN-γ的高效表达，表达的目的蛋白可占茵体总蛋白的55％。用5L和50L发酵罐放量生产的产物，经高效疏水色谱HPHIC直接复性和纯化得到了重组hIFN-γ纯品，其比活性与天然蛋白相近．     

重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

重组人白细胞介素6工程菌的表达和功能初探

自人外周血的mRNA中获得了白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)cDNA,基因被克隆并在大肠杆菌中表达,在20L发酵罐中每L发酵液可得60g湿菌体,IL-6的表达量约占大肠杆菌全蛋白的30%以上,占包含体蛋白的60%。纯化产物在长期,急性毒性和三致实验正常的基础上,用恒河猴的功能实验表明,在不制造血象降低模型的情况下,仍能明显增加血液中血小板和白细胞的数量。     

人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中的表达及产物纯化

目的：构建能高效表达人转化生长因子β1的基因工程菌,优化产物分离纯化的条件,方法：用PCR方法扩增人转化生长因子β1的cDNA,将该cDNA片段插入经改造的pBV220表达载体pBL2的表达框架中,构建了表达菌株RR1／pBL－2－TGF－β1．42℃温控诱导表达,采用谷胱甘肽法,对重组蛋白进行复性。通过阳性离子交换、变性分子筛层析纯化重组蛋白,用MTT法测定重组蛋白的活性。结果：所构建的表达菌株,其TGF－β1的表达量约为15％,重组蛋白的复性率达到30％,经纯化获得了银染一条带的重组蛋白,测活表明和理级具有较强的生物活性。结论：人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中实现了高效表达,获得了具有生物活性的重组TGF－β1。     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

小鼠睾丸特异表达新基因(mtLR1)在大肠杆菌中的表达

根据已经克隆的mtLR1基因序列,采用RT-PCR的方法获得mtLR1基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pMAL-P-2x中,得重组质粒(pMAL-P-2x/mtLR1)并转化大肠杆菌(E．coli)DH5α．经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,重组蛋白得到了正确表达,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的52％,分子质量约为73 kDa。mtLR1蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

重组人肿瘤坏死因子粗提取工艺的研究

通过研究重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的粗提取工艺中各操作条件对目标蛋白纯化的影响,发展了一条纯化rhTNF-α的集成化工艺.该工艺组合细胞破碎,热变性与硫酸铵分级沉淀,有效节省离心步骤,缩短工艺流程,所得粗提物中目标蛋白占总蛋白含量的57%,目标蛋白回收率为90.3%,活性回收率为85.8%,各项指标均比未集成的工艺有较大程度的提高.     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

美洲拟鲽(Pseudopleuronectes americanus)抗冻肽基因在大肠杆菌中的表达

将美洲拟鲽抗冻肽基因克隆于原核高效表达载体ｐＫＫ２２３－３中,经酶切分析、ＰＣＲ检测筛选出重组克隆ｐＭＫ１１,转化大肠杆菌ＪＭ１０９和ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导２～３ｈ后,超声波裂解细菌产物,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱分子量９ｋＤａ处显示出一条明显的蛋白带,与美洲拟鲽抗冻肽大小一致,表明美洲拟鲽抗冻肽基因在大肠杆菌中表达,为进一步研究抗冻肽基因在大肠杆菌中的表达水平及条件打下基础．     

rhBMP-6的表达和纯化

骨形态发生蛋白(bone　morphogenetic protein，BMP)—6属于转化生长因子(transforming growth fac-tor)—β超基因家族，在骨的形成中具有重要作用，并受雌激素选择性上调．本研究利用RT—PCR从人胎盘组织中扩增BMP—6成熟肽的DNA片段，克隆到pGEx—5x—1中，构建GST—BMP6融合蛋白表达载体pGEx—BMP—6，转化E.coli DH5a．克隆质粒转化的工程菌，经IPTG诱导4h后，高效表达GST—BMP6融合蛋白，在SDS—PAGE上出现一新蛋白带，分子量约为42kD，约占总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在．菌体超声破碎，经0．3％N—十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解包涵体，离心后的上清液加入0．6％　Triton　x—100整合SKL，然后利用谷胱甘肽Sepharose—4B亲和层析纯化．结合GST—BMP6的介质经洗涤、xa因子酶切得到纯度达95％的rhBMP—6蛋白。     

谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质

在成功构建了谷脱甘肽（ＧＳＨ）合成酶基因表达质料（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）的基础上,对不同大肠杆蓖突主菌进行了比较,筛选出高效、稳定表达ＧＳＨ合成酶的工程菌并进行了最佳酶表达条件的研究。结果表明：重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）表达量最高,质粒稳定性好;以５％接各量于３７℃、ｐＨ７．２培养至ＯＤ５５０＝０．５左右,加入诱导剂ＩＰＴＧ（０．ｍｍｏｌ／Ｌ）,同时切换培养条件为３４℃、ｐＨ６     

Expression and purification of bioactive high-purity human midkine in Escherichia coli

Midkine is a heparin-binding growth factor, which plays important roles in the regulation of cell growth and differentiation. The non-tagged recombinant human midkine (rhMK) is therefore required to facilitate its functional studies of this important growth factor. In the present work, rhMK was expressed in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3). The expression of midkine was efficiently induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). After sonication, midkine was recovered in an insoluble form, and was dissolved in guanidine hydrochloride buffer. Renaturation of the denatured protein was carried out in the defined protein refolding buffer, and the refolded protein was purified using S-Sepharose ion-exchange chromatography. The final preparation of the rhMK was greater than 98% pure as measured by sodium dodecylsulfate-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The purified rhMK enhanced the proliferation of NIH3T3 cells.