β－淀粉酶基因在黄单胞菌中的克隆及表达

广泛寄主范围载体ｐＫＴ２１０可在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的协助下转移进入黄单胞菌（革兰氏阴性）中并能稳定存在；来源于枯草杆菌的β－淀粉酶基因与载体ｐＫＴ２１０形成重组质粒ｐＹＬ１，并以其转化大肠杆菌；通过三亲本接合将ｐＹＬ１引入带有利福平抗性的黄单胞菌ＮＫ０１－Ｒ中，通过抗性选择接合子，并测定接合子的淀粉酶水解能力及产胶能力．本文获得一株黄原胶产量比出发菌株提高２０％，且淀粉酶水解能力显著提高的工程菌株．     

缩酮丙酮酸转移酶基因在野油菜单胞菌中的表达

将野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ－Ｂ１４５９菌株的缩酮丙酮酸转移酶基因,在ｐＲＫ２０７３辅助质粒的协助下,经三亲本接合法,导入野油菜黄单胞菌ＮＫ０１小菌落的抗性突变株（ＮＫ０１·Ｓ·１）中,测定各接合子的产胶率、黄原胶粘度及丙酮的含量,得到一系列优于原始菌株的接合子,其中四株的产胶率、丙酮酸含量及黄原胶粘度分别较出发菌株提高７．２８￣１０．６０％、４０．２４     

缩酮丙酮酸转移酶基因在野油菜黄单胞菌中的表达

将野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ－Ｂ－１４５９菌株的缩酮丙酮酸转移酶基因,在ｐＲＫ２０７３辅助质粒的协助下,经三亲本接合法,导入野油菜黄单胞菌ＮＫ０１小菌落的抗性突变株（ＮＫ０１·Ｓ·１）中,测定各接合子的产胶率、黄原胶粘度及丙酮酸含量,得到一系列优于原始菌株的接合子,其中四株的产胶率、丙酮酸含量及黄原胶粘度分别较出发菌株提高７．２８～１０．６０％、４０．２４～４１．４２％和１０．７９～２２．３０％．     

具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体经三亲本杂交用４组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌Ｒ１的染色体ＤＮＡ,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ－５α感受态细胞,得到１２个转化子（Ｔ１￣和２）,其抗性水平分布在１０￣５００ｍｇ／Ｌ的区间内,将这些转化子所含质粒分别命名为ＰＳＸ１￣ＰＳＸ１２,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源ＤＮＡ片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子Ｔ１     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

野油菜黄单胞菌8004胞外酶及多糖合成正负调控基因在…

利用野油菜黄单胞菌８００４正、负调控胞外酶及多糖合成的基因片断分别经三亲本接合方法导入黄单胞菌ＮＫ０１抗性突变株中，测定接合子四种胞外酶活力和多糖合成能力，确定该正、负调控基因对ＮＫ０１的作用。结果表明，负调控基因作用明显，使ＮＫ０１胞外多糖及胞外酶产量显著降低，正调控基因未见明显的胞外酶及多糖合成的增强作用。本文将对正、负调控基因的作用方式作了初步探讨。     

多能硫杆菌RubisCO基因的亚克隆及各种启动子对其表达的影响

将多能硫杆菌ＲｕｂｉｓＣＯ基因从两个方向亚克隆到ｐＢＲ３２２和ｐＫＫ２２３－３载体上，通过酶切的方法对各种质粒的插入方向进行了确证。并进一步对这两种插入方向的质粒在大肠杆菌中的表达情况进行了酶活性的测定，该基因片段在ｐＫＫ２２３－３载体的ｔａｃ启动子的启动下，表达活性比ｌａｃ妄动子以及ｐＢＲ３２２载体上的Ｐ１和Ｐ２启动子高。     

林可链霉菌噬菌体φSL60启动子的克隆与鉴定

以启动子探针质粒ｐＩＪ４８６为载体,变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３作受体,克隆了林可链霉菌噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ上的启动子活性片段。以ｐＵＣ１８为载体构建ＳＬ６０ＤＮＡ之ＫｐｎＩ片段的基因文库,从中筛选出两个片段,分别克隆于ｐＩＪ４８６中获得ｐＵＩＳ２９和ｐＵＩＳ１９８,在ＭＭ培养基上,两者的转化子对卡那霉素的抗性均仅为１０ｍｇ／Ｌ。噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ的ＢｇｌＩ片段直接克隆入ｐＩＪ４８６的ＢａｍＨＩ位点,获得重组质粒ｐＭＭＳ１,其转化子的卡那霉素抗性在ＭＭ培养基上可达２５０ｍｇ／Ｌ。分析表明ｐＭＭＳ１上的插入片段约为９２０ｂｐ,含有一个ＳｓｔＩ位点,四个ＭｂｏＩ位点。该片段用ＭｂｏＩ部分酶解缩小到６００ｂｐ,亚克隆入ｐＩＪ４８６中得到重组质粒ｐＭＳＢ１４,其转化子对卡那酶素的抗性水平提高到３００ｍｇ／Ｌ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,ｐＭＳＢ１４中的ｎｅｏ基因可以表达出氨基糖苷磷酸转移酶（ＡＰＨＩ蛋白）。这些结果表明ｐＭＳＢ１４中的插入片段可能具有较强的启动子活性。     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物,用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中,用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段,分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同,目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片…

用大肠杆菌启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达。当用限制酶ＸｂａＩ去除其５’－端１．２ｋｂ片段后，３’－端片段仍能启动Ｋａｎ’基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ，但当１．２ｋｂ片段反向回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ。将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ’ａｄｌｄ     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

枯草芽孢杆菌TF2磺胺胍抗性基因的克隆和表达

采用鸟枪法将枯草芽孢杆菌磺胺胍抗性基因克隆到质粒ｐＵＢ１１０中建成重组质粒,ｐＢＵＷ４,该质粒的分子量约８．１ｋｂ,标记为ＳＧ＾ｒ为Ｋｍ＾ｒ,将ｐＵＢＷ４转化到肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Ｑ２９０１－４菌株中,得到的转化子产肌苷能力比受体菌提高２５．５％。     

环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）的转化和中性蛋白酶基因的表达

用枯草芽胞杆菌质拉载体ｐＮＱ１２２和含有中性蛋白酶基因的重组质粒ｐＭＰＲ８转化环状芽胞杆菌Ｃ－２，转化频率为１．０×１０３转化子／μｇＤＮＡ．含有ｐＭＰＲ８的转化子能在酪蛋白平板上形成清晰的水解圈，其蛋白酶活性与相同质粒转化枯草杆菌ＤＢ１０４所得酶活性相近．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证实了转化细胞中存在质粒ｐＮＱ１２２和ｐＭＰＲ８，两种质粒在该菌中的稳定性差别很大．     

β—内酰胺酶基因在谷氨酸产生菌T6—13染色体上的…

以质粒ｐＵＣ１３编码的β－内酰胺酶基因为外源基因，通过随机连接谷氨酸产生菌Ｔ６－１３染色体ＤＮＡ片段后转化Ｔ６－１３原生质体，使其整合到染色体上，得以表达。在实验条件下，所测１９株转化子的抗性都有很高的稳定性，其中１０株能百分之百地保持抗性。经生物素标记的ｐＵＣ１３为探针的分子杂交实验证实抗性基因已整合到Ｔ６－１３菌染色体ＤＮＡ上。     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体克隆嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ８９启动子的研究，用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ分别消化嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ８９染色体ＮＤＡ和质粒ｐＫＫ２３２－８，在体外重组，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性性平板上筛选转化子，结果从ＮＴＴ８９染色体ＤＮＡ中克隆到一系列带有启动子活性的ＤＮＡ片段，并在大肠杆菌中得到表达，这些转化子抗氯霉素水平在３４－５００ｍｇ     

氧化硫硫杆菌质粒pTt12复制原点片段分离及其重组质粒pSDT …

氧化硫硫杆菌重组质粒ｐＳＤＴ１２５在ＲＰ４质粒的带动下以高出ｐＢＲ３２５两个数量级的频率在大肠杆菌之间转移。转移后,ＲＰ４和ｐＳＤＴ１２５以分离的形式共存于接合转移子中。该质粒不能被ＳＭ１０菌株染色体上的ｔｒａ基因带动转移。以ｐＳＤＴ１２５质粒为基础,通过亚克隆构建了两个质粒ｐＳＤＴ１２５０,ｐＳＤＴ１２５１。二者可以被ＲＰ４质粒带动在大肠杆菌之间转移,转移频率与ｐＳＤＴ１２５相近,没有明显降低。