真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱色中的应用

较为详细地介绍了漆酶常用的定性和定量分析方法，并阐述了漆酶在织物染料脱色中的应用。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，按其主要来源分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类。研究表明，漆酶可作用的底物范围广，它可应用于生漆的干燥的干燥成膜和毛发染色，纸浆生产中木质素的降解，废水处理，生物传感器，酶法免疫分析，有机合成，土壤的修复等方面。     

漆酶与各种类型底物反应性能的微量热法研究

在厌氧条件下，用ＬＫＢ－２１０７Ｂａｔｃｈ微量热系统研究了在２９８．１５Ｋ０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲溶液（ｐＨ７．４）中漆树漆酶与５种底物的反应，测定了各反应的反应焓变△Ｈｍ米氏常数Ｋｍ，酶底复合过程的吉布斯自由能△Ｇ０复合物中电子转移速率常数ｋ２，以及漆病对各种底物的催化活性ＥＡ．讨论了相同的实验条件下，各种酶底复合物的稳定性，底物官能团及其位置对酶反应中的电子转移速率和非酶反应中自由基聚合形式     

漆树营养液对漆树生长及生漆质量的影响

以提高生漆的质量为目标,用专门配制的含磷、钾、硼、铜、镁等矿质元素和生长调节物质的"漆树营养液"对毛坝漆树进行喷施处理,观察漆树的生长情况并检测生漆质量.试验结果表明:①处理组较对照组漆树生长茂盛,树皮增厚,漆树落叶时间延长半个月左右,且无毒副作用;②处理组较对照组漆树所产生漆的漆酚、漆酶、树胶质等主要化学成分的含量增加;③处理组较对照组漆树所产生漆的感官检验指标明显改善;④处理组较对照组漆树所产生漆的表干时间缩短.其机理是施用"漆树营养液"后漆树的营养条件改善了,生漆的代谢合成能力增强了.施用"漆树营养液"可促进漆树生长并提高生漆质量.     

漆树漆酶的催化氧化作用：Ⅸ.含叔丁基的儿茶酚类底物…

用分光光度法对６个含叔丁基的儿茶酚类底物在不同ＰＨ条件下的离解和漆酶催化氧化行为进行了考察，测定了它们的在ＰＨ８．０时的反应速度常数。结果表明，叔丁基的疏水性较好地适应了漆酶对底物疏水程度的要求，使这类底物更容易为漆酶所包结；漆酶活性中心周期的酸性氨基酸残基中的羧基阴离子所提代的ＰＨ环境和质子转移作用，促进了这类底物的离解，使这类底物能在远低于基一级离解所需ＰＨ的环境中进行反应，速度常数数据显示，     

漆树漆酶的催化氧化作用(Ⅻ)——儿茶酚胺氧化中间体的捕获

在静止条件下，用分光光度法对３个儿茶酚胺底物的漆酶催化氧化行为进行了考察．ＥＳＲ结果证明，这些底物在弱碱性条件下的漆酶催化反应经历了半醌自由基阴离子的阶段，Ｍｇ２＋离子的存在，提高了邻苯半醌自由基的动力学稳定性．结果还表明，儿茶酚胺底物的漆酶催化氧化产物，结构十分复杂，用二苯乙二胺只能捕获到少量对位羟基化的邻醌．     

漆树漆酶的催化氧化作用Ⅺ原儿茶酸酯类的漆酶酶催氧化

用分光光度法对原儿茶酸甲酯、正丁酯、正辛酯底物在不同ｐＨ条件下的离解和漆酶催化氧化反应进行了考察，测定了它们在ｐＨ＝８．０时的反应速度常数．结果表明，不为漆酶所喜爱的亲水性底物（原儿茶酸），经过适当疏水化处理，可以有效地改善其反应性和提高漆酶的催化活性．ＥＳＲ结果证明，这些底物的漆酶催化反应都经历了半醌自由基阴离子阶段；酯基的存在不能保证底物顺利地氧化成相应邻醌，用二苯乙二胺只能捕获到少量羟基化的邻醌     

漆树漆酶的催化氧化作用（Ⅻ）：儿花酚胺氧化中间体…

在静止条件下，用分光光度法对３个儿花酚胺底物的漆酶催化氧化行为进行了考察。ＥＳＲ结果表明，这些底物弱碱性条件下的漆酶催化反应经历了半醌自由基阴离子的阶段，Ｍｇ＾２＋离子的存在，提高了邻苯半醌自由基的动力学稳定性。     

Ag+离子对漆树漆酶催化活性的抑制作用

以5,6-二溴-2,3-二氰基氢醌(DDBQH2)为底物,在pH值4.4和30±0.2℃条件下,用分光光度法考察了Ag+离子对漆树漆酶催化活性的影响.结果表明,Ag+离子对DDBQH2的漆酶催化氧化反应有明显的抑制作用,这种作用具有罕见的反竞争性特征,抑制剂常数Ki=(2.1±0.5)×10-5mol.dm-3.     

漆树漆酶的催化氧化作用：Ⅺ原儿茶酸酯类的漆 …

用分光光度法对原儿茶酸甲酯，正丁酯，正辛酯底物在不同ｐＨ条件下的离解和漆酶催化氧化反应进行了考察，测定了它们在ＰＨ＝８．０时的反应速度常数。结果表明，不为漆酶所喜爱的亲水性底物，经过适当疏水化处理，可以有效地改善其反应性和提高漆酶的催化活性。     

漆树漆酶催化氧化对苯二胺反应的微量热法研究

在厌氧条件下，０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲溶液中，用微量热法测定了２９８．１５Ｋ的漆树漆酶与对苯二胺反应的摩尔反应焓ΔｒＨｍ＝－１６３．３６±０．３６ｋＪ／ｍｏｌ米氏常数Ｋｍ＝５．５８×１０＾－３ｍｏｌ／Ｌ和表现一级反应速率常数ｋ１＝８．６３×１０＾－３ｓ＾－１及此条件下用对苯二胺作底物时的漆酶活性值ＥＡ＝０．０４５ＩＵ。     

邻苯二胺与漆树漆酶反应的微量热法研究

在厌氧条件下,0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PH7.4)中,用微量热法测定了298.15K时漆树漆酶与邻苯二胺反应的摩尔反应焓△rHm=-293.58±0.29KJ/mol,米氏常数Km=0.103mol/L和表现一级反应速率常数k_1=9.42×10~(-4)S~(-1)及此条件下邻苯二胺作底物时的漆酶活性值E_A=O.1103IU.     

漆酶的分子生物学研究及其应用

白腐菌所分泌的木质素降解酶主要有3种：木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶．漆酶是近年来研究较多的一种含铜的多酚氧化酶，在白腐菌中普遍存在，也存在于少数低等真菌和植物中．漆酶多为酸性蛋白，含4个铜离子，形成3个活性区域；表面一些氨基酸被不同程度地糖基化．漆酶可催化的底物迭250种，铜离子结合区域在其催化氧化过程中起决定性作用．运用PCR技术cDNA文库技术，越来越多的漆酶基因被克隆，目前已克隆到的漆酶基因有大约20个．许多来源地基因都是以家族地形式存在于染色体上的．已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子，这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性．一些特珠序列存在与否决定了该酶的表达形式-诱导型或组合型．目前已有部分漆酶基因的异源表达获得成功．本文还介绍了漆酶在环境保护、造纸工业、食品工业等方面的应用．对近年来漆酶的研究进展进行了综述．     

蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定

采用分光光度法测定密环菌（Armillaria mellea）胞外漆酶（Laccase）的活力,分别以2,2′－连氮－二（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸）（简称ABTS）、丁香醛连氮、愈创木酚和邻联甲安为底物,比较了这4种底物对漆酸的敏感性,探讨了酶反应时间、温度、缓冲液及其pH值和底物与酶的用量等条件对漆酶催化反应的影响,实验结果表明,适宜的测酶条件可以确保漆酶活力的测定快速而准确。     

不同来源重组漆酶的酶学特性

以来源于变色栓菌的同工酶LacA、LacB、LacC,杂色云芝的同工酶Lcc1、Lcc2,以及细菌ARA等6种重组漆酶为研究对象,比较了它们的最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、动力学常数K_m,以及Cu²⁺对漆酶酶活的影响等酶学特性。结果表明:以邻联甲苯胺为底物时,LacA、LacB、LacC、Lcc1、Lcc2、ARA的最适反应温度分别为60、60、70、60、55和75 ℃; 以愈创木酚为底物时,6种漆酶的最适反应pH分别为5.0、5.0、4.5、5.0、4.5、7.0。LacA在催化ABTS、愈创木酚、邻联甲苯胺、丁香醛连氮以及2,6-二甲基苯酚时,其最适反应温度分别为55、70、60、20、65 ℃。此外,真菌漆酶在30～60 ℃,pH为2.5～7.0范围内都有较好的稳定性,细菌来源的漆酶在80 ℃下保持60 min,在pH=7.0时保持6 h仍具有较高的酶活力。Cu²⁺对细菌漆酶的激活作用要明显高于真菌漆酶。同时,以ABTS为底物时,K_m值最小,且不同来源漆酶的K_m值相差不大。因此,6种不同来源的重组漆酶在催化同一种底物时,酶学特性存在着差异性,同一种重组漆酶在催化不同底物时,其酶学特性也有较大差异。     

灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

将灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶经过Sephadex G-75和DEAE-Sepharose Fast Flow两步纯化,获得具有3个同工酶的组分,并且纯度提高了81倍,酶活回收率高达83.9%。以ABTS为底物,漆酶最适pH值是2.2～2.6,在pH值4.6～7.8范围内稳定;最适温度45℃,在低于45℃时较稳定。大部分金属离子、酸根离子对灵芝漆酶普遍有抑制作用,除盐可以提高漆酶活力。     

漆酶对共基质体系下吲哚的去除研究

采用漆酶对低浓度单基质吲哚及与苯酚共存下低浓度吲哚进行去除实验。结果表明,与单基质相比,含有苯酚的体系中,漆酶对吲哚的去除效果更好;漆酶不仅可以同时去除共基质中的苯酚和吲哚,苯酚的存在还促进了漆酶对吲哚的去除;共基质体系中,苯酚浓度与吲哚的去除率有较好的线性相关性,苯酚的中间产物可能与漆酶组成了新的介体系统,促进了吲哚的氧化;与单基质相比,共基质体系中漆酶对吲哚的去除有两个较优的pH值,分别为3.5和6.5,且苯酚的加入可以减小漆酶的用量。     

漆树漆酶的催化氧化作用：Ⅶ.稀土金属离子对漆酶催化…

以５，６－二溴－２，３－二氰基氢醌为底物，在ｐＨ４．０－６．０条件下，用分光光度法考察了稀土金属离子对漆酶催化活性的抑制作用，探讨了抑制特征，抑制位点和作用方式。结果表明，稀土金属离子对漆酶催化活性的抑制属竞争性抑制过程。稀土金属离子的抑制作用是通过它 与漆酶活性中酸性氨基酸残基中的ω－羧基阴离子的配位相互作用实现的；在这种作用下，ω－羧基阴离子于对底物酸羟基的氢键或碱化催化作用补削弱，使酚羟基中     

木质素降解真菌粗毛栓菌(Trametes gallica)蓝色漆酶的分离纯化及性质研究

作者对粗毛栓菌(Trametesgallica)在PAG培养基条件下摇瓶培养产生漆酶的情况进行了研究.15d左右达到产酶高峰,随后进入平台期.对15d产生的漆酶进行分离纯化.4L发酵液经硫酸铵沉淀,DEAE SepharoseFastFlow柱层析和SephadexG 100柱层析,漆酶被纯化了36.9倍.经SDS PAGE验证为一条带,表观分子量约为60,000Da.纯化漆酶是一种含糖量6%的糖蛋白,且在605nm处具有蓝色漆酶Ⅰ型铜离子典型的吸收峰.以ABTS,DMP和愈创木酚为底物,反应的最适pH值分别为2.2,3.0和4.0;Km值分别为0.172×10-2,0.51,0.48mmol/L.以ABTS为底物,最适反应温度为70℃.在pH7～9处理24h,纯化漆酶仍保持较高活性.EDTA,卤素离子,NaCN和NaN3对酶活有抑制作用,其中NaN3是最强的抑制剂.纯化的蓝色漆酶不具有氨酸酶活性,但能够氧化非传统底物酚红.     

AOPAN纳米纤维膜的制备及其固定化漆酶研究

利用静电纺丝和偕胺肟化改性制备偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)纳米纤维膜,以戊二醛为偶联剂,其两端的醛基分别与AOPAN纳米纤维膜和漆酶上的氨基反应,进而固定化漆酶.研究了戊二醛交联条件与固定化漆酶的关系,同时测定了固定化漆酶的相关性能,结果表明,当戊二醛质量分数为5%、处理时间为10h时,固定漆酶效果最好.对游离漆酶与固定化漆酶进行酶促动力学分析发现,固定化漆酶与底物具有较好的亲和性.相对游离漆酶,固定化漆酶对温度和pH值的变化也表现出更好的稳定性,同时具备良好的储存稳定性和重复使用能力.固定化漆酶在4℃下保存20d,酶相对活性保持在63.6%以上,固定化漆酶经重复使用10次,酶相对活性保持在65.7%以上.     

我国漆树资源综合利用之我见

漆树是我国特有的最具民族特征的经济林木，主要分布在秦岭、大巴山、巫山、武陵山、大娄山、乌蒙山和邛崃山一带。漆树资源主要产品是生漆，中冈是世界生漆主产国，也是重要的出口农产品，湖北利川的“坝漆”是其中的佼佼者。生漆是目前自然界发现的由植物产生的能常温同化成膜的仅有的物质。下面就对漆树资源开发利用的一些问题谈一点自己的粗浅看法。