耐热FD DNA多聚酶在PCR中的应用条件

探索了用于多聚酶链式反应(PCR)的FD DNA多聚酶的最适反应条件在100μl的反应液中含有25 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0),25 mmol/L的(NH_4)_2SO_4,1.5 mmol/L的MgCl_2,200 μg/ml的明胶,dNTP各200 μmol/L,模板量为3.3×10～(-2)Pg,引物量各为290 nmol/L,1～2 U的耐热FD DNA多聚酶,30次循环反应的系统为通用PCR最适反应系统。应用这一反应系统,混迹于大量DNA分子中的特定DNA片段可借助于琼脂糖凝胶电泳专一性地、快速而有效地检出。     

应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应（PCR）的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

稀土离子对TaqTMDNA聚合酶的抑制机理

在PCR扩增水平上研究了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制机理,采用动态荧光比色法测定PCR扩增产物浓度，证明了La^ 3和Ce^ 3在10～50μmol／L抑制DNA复制是由于其抑制了Taq^TMDNA聚合酶的活性所致,且该抑制属竞争性的抑制，得到了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制常数分别为12．7μmol／L和14．4μmol／L。     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

T7 DNA 聚合酶基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应技术,从Ｔ７噬菌体中选择扩增编码Ｔ７ＤＮＡ滞酶５’→３’聚合酶的基因序列,扩增片段利用引入的酶切位点克隆至载体ＰＳＫ上,从而得到了不含有３’→５’外切酶基因的Ｔ７ＤＮＡ聚合酶基因,并将该重组基因克隆至原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ上,在大肠杆菌中进行了表达。     

前列腺素E_1的化学-酶促合成

以γ-亚麻酸甲酯为起始原料 ,采用化学 -酶促合成技术 ,经两条不同路线合成前列腺素E1,总收率分别为 1 3%和 1 6% .关键中间体及最终化合物的结构经元素分析、核磁共振氢谱及碳谱得到确认 .合成中避免使用高温、高压反应 ,适合于工业化生产 .     

在反胶束中酶促合成短肽的研究进展

短肽广泛存在于生物体内,目前已成为世界范围内研究的热点之一。大量研究表明,人工合成短肽具有高效、专一性、易分离等优点。本文对在反胶束中酶促合成短肽的进展进行了综述,并对其应用进行了展望。     

人乳铁蛋白阳离子多肽重组Taq DNA聚合酶的研究

本文报道了人乳铁蛋白阳离子多肽(HL-N)替换Taq DNA聚合酶N-末端结构域,构建新型重组Taq酶的研究结果.利用合成寡核苷酸,成功获得具DNA合成功能的HL-N重组Taq酶.对该重组酶的DNA合成加工、血清耐受性等测试显示,HL-N重组Taq DNA聚合酶的DNA扩增速度、扩增物产量、以及对反应体系中血清浓度的耐受性都得到显著提高.     

真核生物DNA聚合酶δ的研究现状

DNA聚合酶δ(DNA polymerase δ)是真核生物DNA复制的主要复制酶,同时还参与DNA修复,对保持真核生物基因组的结构完整性和遗传稳定性具有重要作用.对DNA聚合酶δ蛋白功能活性及其基因表达机制的研究因受技术上的限制而未能深入研究.由于其重要的生物学功能,目前引起人们的更多关注和重视.文中就该酶的生物学功能、亚基组成、核心酶的分子表达调控以及与其他蛋白相互作用等方面对国内外DNA聚合酶δ的研究进行简要综述.     

胞苷二磷酸胆碱酶促合成的研究

研究了胞苷三磷酸和磷酸胆碱在啤酒酵母磷酸胆碱胞苷酰转移酶催化作用下,直接合成胞苷二磷酸胆碱的反应条件,包括最适pH,底物浓度、镁离子浓度及反应时间的选择。在最适反应条件下转化率可达58%。此外,还测得了胞苷三磷酸的表观米氏常数K_M2×10~(-2)M,对酶的分离也作了初步的探索。     

微量量热法研究酸度和金属离子对淀粉酶催化作用的影响

利用热活性检测仪测定了在不同酸度和有抑制剂时淀粉在淀粉酶催化作用下的热功率-时间曲线.根椐酶催化反应动力学理论和对比进度法对实验结果进行处理,确定了酶催化反应的最适酸度,得到了有抑制剂(Li+,K+)时酶催化反应的表现米凯利斯常数（K′m）和最大速率（Vmax）. 定量比较了金属离子对酶催化反应的抑制效果.     

耐热性重组Taq DNA酶的制备及鉴定

利用含Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株,用异丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)诱导10～12h表达耐热Taq DNA聚合酶;然后溶菌酶、NP40裂解细菌;硫酸铵沉淀、4℃下透析;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。结果表明分离纯化制备的耐热性Taq DNA聚合酶,其纯度、浓度和活性均可与同类产品相比,比活性达20000U/mg,能有效扩增出DNA片段。     

Inhibition of DNA restrictive endonucleases and Taq DNA polymerase by trimalonic acid C60

Activities of trimalonic acid fullerene (TMA C_60) on DNA restrictive enzymatic reaction were investigated by using two restrictive endonucleases Hind III and EcoR I and plasmid pEGFP-N1 with single restric-tive site for both enzymes. Meanwhile, TMA C60 was also tested to clarify its effects on polymerase chain reaction (PCR) with the catalyst of Taq DNA polymerase and the template of plasmid pEGFP-N1. The products from restrictive reactions or PCR were detected by agarose gel electrophoresis. It was found that the product amounts from restrictive reactions or PCR decreased significantly with addition of TMA C60. The inhibition by TMA C60 was dose-dependent and IC50 values for reactions of Hind III, EcoR I and PCR were 16.3, 6.0 and 6.0 μmol/L, respectively. Addition of two scavengers of reactive oxygen species (ROS), L-ascorbic acid-2-phosphate ester magnesium and sodium azide at the con-centrations of 2―10 mmol/L did not antagonize the activities of TMA C60 against PCR and two restrictive reactions. However, increase of Taq DNA polymerase amounts in PCR system antagonized the activities of TMA C60. These data implied that TMA C60 was able to inhibit the activities of the three above-mentioned enzymes involved in DNA metabolism, and that this inhibition probably did not correlate to ROS.     

Expression of human cytomegalovirus DNA polymerase in insect cells using baculovirus expression system: Purification and biochemical characterizations

Human Cytomegalovirus (HCMV) DNA polymerase gene was overexpressed in insect cells using the baculovirus transfer system. A6. 2 kb HCMV Rsr II-EcoRI DNA fragment with intact HCMV pol gene coding sequence was engineered into NheI site of vector pBlueBac under the control of polyhedrin promoter of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Recombinant AcNPV carried HCMV pol gene was generated by cotransfection of Spodoptera frugiperta cell (SF21) with AcNPV DNA and baculovirus transfer vector with HCMV pol gene. Infection of SF21 cell with recombinant virus lead to the expression of 140 kD peptide of HCMV specific DNA polymerase at the level approximately 2 mg per 10⁸ cells. The polypeptide was purified from the infected SF21 cells by a series of column chromatography to homogeneity. The purified enzyme had a molecular weight of 140 kD and reacted with antiserum specific for HCMV DNA polymerase. It exhibited both 3′–5′ and 5′–3′ exonuclease activities. This enzyme is also sensitive to phosphono acetate. Ye Linbai: born in Feb. 1948. Professor. Current research interest is in Vitology and Molecular Biology Supported by Public Health Service Grants CA21773, CA15036 and AI12717 from the National Institutes of Health     

红外热像技术探测硫化矿石自燃火源的影响因素及其解决方法

红外热像技术已成为火源探测的一种新方法,但其应用于井下自燃火源探测的实际操作中还存在许多不足。为了准确、快速地获取自燃矿石表面的温度场,初步探讨了发射率、感温距离、背景噪声、井下环境及热像仪稳定性等因素对探测结果的影响。通过试验,确定了硫化矿石表面的热发射率和使用IRI-1011热像仪探测系统测温时的合理距离。试验结果表明。硫化矿石表面的热发射率E=0．88;常温下10m探测范围内,随着探测距离的增大,感温误差明显增大;热源温度一定时,3m、4m距离的感温误差几乎呈线性增大;热源温度T〉50℃时,2m距离的感温误差趋于稳定。在试验基础上,采用数据拟合的方法,建立了热像仪感温与矿石表面实际温度间的定量关系。现场应用证明该研究结果实际可行。     

酶催化合成聚酚树脂的研究进展

概述了酶催化合成聚酚树脂用酶的种类、底物的结构、反应介质;比较了该树脂和传统酚醛树脂的生产、结构及性能特点;指出了其不仅具有良好的耐热性能,可作传统酚醛树脂的替代品,而且具有导电、发光等功能,在光电材料方面显示了极强的应用潜力,但降低HRP催化合成聚酚树脂的成本是其实现工业化亟待解决的问题。     

DNA microarray synthesis by using PDMS molecular stamps (Ⅲ)-- Optimization for the reaction conditions

Optimization for the technological processes of fabricating oligonucleotide microarray by the molecular stamping method is studied in this note. Three factors that affect the pressing coupling reactions of the nucleosides are focused on: the stability of the chemical activities of the reaction solutions, the contamination of the remain of the reactive nucleotides among the different spots on the chip, and the influence of the capping reaction on the hybridization result. The experiments show that the acetonitrile solution of tetrazole and nucleoside monomer could maintain sufficient reactive activity for more than 10 h. An effective method has been used and proved to eliminate the residual reactive nucleosides on chip with small molecules containing hydroxyl group. Finally, the capping step-- a regular step in the conventional DNA chemical synthesis can be neglected in our on-chip DNA synthetic process, which would not affect its hybridization results.     

合成肉桂酸正丁酯固体酸催化的研究进展

介绍了对甲苯磺酸、甲烷磺酸盐、强酸性阳离子交换树脂、六水三氯化铁、聚氯乙烯三氯化铁树脂、五水四氯化锡、十二水合硫酸铁铵、硫酸镓、硫酸高铈、一水硫酸氢钠、硫酸氢钾、固体超强酸和杂多酸等固体酸催化剂催化合成肉桂酸正丁酯的方法.它们是催化合成肉桂酸正丁酯的良好催化剂.微波辐射是合成肉桂酸正丁酯的良好方法.