PCR法检测一株啤酒腐败菌条件的优化

以短乳杆菌(Lactobacillus brevis)为研究对象,对PCR法快速检测短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的扩增条件:Taq酶浓度、Mg2+浓度、退火温度、循环温度/时间、循环次数5个方面进行了优化。最终得到PCR反应最佳条件:25ul体系中,Taq酶用量2.0U/ml,Mg2+浓度2.0mM退火温度为50℃。扩增程序:94℃4min进入循环,94℃30s,50℃30s,72℃30s,35个循环后,再72下延伸5min。     

粗壮女贞RAPD-PCR实验体系优化的研究

以粗壮女贞嫩芽为材料,对粗壮女贞RAPD分析中一些重要影响因素,包括模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度、Taq酶用量、退火温度、延伸时间以及循环次数等因子进行了比较系统的摸索和优化.建立了适合粗壮女贞RAP-PCRD分析的优化反应体系:即25μl 反应体系中Mg2 浓度为2.5mM,dNTPs浓度为200μM,Taq酶用量为2.0U,引物浓度为10pmol,模板浓度为80ng.PCR扩增程序为:94℃预变性4min,然后按94℃变性30s,37℃退火45s,72℃延伸120s,进行40个循环,最后于72℃延伸10min.以该优化的RAPD条件进行重复实验,其实验结果重现性良好.     

Idaho Rapidcycler PCR仪上用薄壁管进行RAPD扩增的程序优化

以尾叶桉DNA为材料,对IdahoRapidcycler扩增仪上用薄壁管进行RAPD扩增的程序进行了优化研究。通过逐步对退火、延伸和变性的温度和时间及总的循环次数设置不同梯度和亚梯度,比较不同梯度和亚梯度的扩增结果,确定优化程序为:93℃预变性1min;再40次循环:93℃变性20s,38℃退火21s,72℃延伸1min;最后72℃延伸7min。该程序的扩增时间较短,具有较好的特异性和重复性。另外,薄壁管反应架在反应室的内位比同时扩增的外位效果差,扩增时只能利用外位。     

赤松ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立赤松ISSR-PCR反应体系,利用正交试验分别对影响赤松PCR反应的dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、Taq酶浓度、引物浓度、模板浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度和循环次数.最终确定赤松ISSR-PCR最佳反应体系及扩增条件为:25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR Buffer、3 mmol·L~(-1)dNTP、1.5 mmol·L~(-1)Mg~(2+)、0.5 U Taq酶、0.3μmol·L~(-1)引物、9 ng模板;扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行94℃变性30 s,55℃退火45 s(退火温度随引物不同而变化),72℃延伸2 min,35个循环,最后72℃延伸7 min.这一ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR技术对赤松进行物种分类鉴定奠定了基础.     

水稻基因组DNA的RAPD扩增研究

通过对水稻RAPD反应条件比较研究,建立了对除草剂敏感致死水稻RAPD的最适反应体系和反应扩增程序,即在25μl反应体系中,含10 mM Tris-HCl(pH8.0),10 mM KCl,8 mM(NH4)2SO4,0.05%NP-40,2.0 mM MgCl2,0.1 mM(each)dTNPs,20 ng引物,20ng基因组DNA,1.5 U的Taq酶.反应扩增程序为:94℃变性2 min;扩增40个循环,每循环包括:94℃变性10 s,40℃退火30 s,72℃延伸1.5 min;最终延伸5 min.     

应用RAPD技术初步分析无裂栉江珧四种类型的基因组DNA

利用3个随机引物(S453，S454，S463)对无裂栉江珧(Atrina pectinata Linaeus)的4种类型：青口、黄口、沙螺、棘螺基因组DNA进行RAPD分析，并对RAPD的实验条件行了优化研究。10～20ng的高纯度DNA用作模板，退火温度为39℃时，RAPD扩增的效率较高，扩增的带纹清晰可辨。3个引物中，引物S453和S463获得了清晰的RAPD扩增结果，引物S454未获得有效扩增，共扩增出8条清晰的DNA片段。8条清晰的类群特异或类群共享的DNA片段，能将沙螺、棘螺、油螺(青口与黄口的合称)区分开来，尚未发现能将青口与黄口分开的RAPD扩增带。     

Idaho Rapidcycler PCR仪上用薄壁管进行RAPD扩增的程序优化

以地桉ＤＮＡ为材料,对Idaho Rapidcycler扩增仪上用薄壁管进行ＲＡＰＤ扩增的程序进行了优化研究,通过逐步对退火、延伸和变性的温度和时间及总的循环次数设置不同梯度和亚梯度,比较不同梯度和亚梯度的扩增结果,确定优化程序为：９３℃预变性１min;再４０次循环：９３℃变性２０s,38℃退火２１s, 7２℃延伸７min。该程序的扩增时间较短,具有较好的特异性和重复性。另外,薄壁管反应架在反应室的内位比同时扩增的外位效果差,扩增时只能利用外位。     

黑老虎ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化特色药食两用植物黑老虎（Kadsura coccinea）的ISSR-PCR反应体系和扩增程序,通过正交和单因素试验研究Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数等因素对黑老虎ISSR-PCR反应体系扩增效果的影响。结果表明,在20 μL的反应体系中,最佳扩增条件为Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.1 mmol/L、引物浓度0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.50 U、模板DNA用量45 ng,退火温度50.4℃,循环40次。这一优化体系的建立可为深入开展黑老虎种质资源遗传多样性研究奠定基础。     

油松遗传多样性研究的ISSR—PCR体系优化与初步应用

以油松基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR的主要因素进行研究,建立了适宜于油松的ISSR-PCR优化体系及扩增程序;并采用lSSR标记对山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的遗传多样性进行了分析,同时将此结果与使用RAPD标记的研究结果进行了对比.结果表明,在20μL反应体系中,模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物5种主要成分的最适浓度分别为40 ng、2.5 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1、1 U和0.5 μmol·L-1.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30s,最适温度(54～56℃)退火45s,72℃延伸2min.共计35个循环;循环结束后72℃延伸7min,4℃保存.山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的Nei's遗传多样性分别为0.3520和0.3514,前者的遗传多样性显著高于后者(P<0.001).使用ISSR标记与RAPD标记所获结果基本一致,但是lSSR标记优于RAPD标记.     

铁皮石斛野生居群研究(Ⅳ):RAPD反应体系的构建与优化

为获得铁皮石斛RAPD的最佳反应体系,本文对影响RAPD反应的模板含量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、扩增程序及退火温度等多种因子进行了构建与优化.通过各因子的组合研究,我们得到铁皮石斛RAPD反应最适扩增体系是:25μLPCR反应体积,10×Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L MgC l2,dNTP 2.5μL(各2.5mmol/L),模板DNA为30 ng,Taq聚合酶1.5 U,随机引物12 pmol,ddH2O 14.2μL.最佳扩增程序:94℃预变性3m in,94℃变性50 s,38℃复性1 m in,72℃延伸2 m in,循环40次;最后72℃延伸5 m in.4℃保存.