花生几丁质酶的纯化及酶学性质研究

本课题利用亲和色谱和凝胶过滤色谱法从花生种子中分离得到了几丁质酶.经SDS-PAGE鉴定,该酶蛋白已达电泳纯,分子量约34.4 kD.在还原和非还原状态下均显示单一区带,表明其为单体蛋白.此外,通过等电聚焦法可测得该酶等电点为5.1.而酶学性质的相关研究则表明:该酶最适pH为5.4,最适反应温度为40～50℃.     

菠菜叶绿体蛋白质的提取与分离

以菠菜叶片为材料运用亚细胞分离技术——蔗糖密度梯度离心分级分离得到完整叶绿体,再利用多种不同裂解液分步顺序处理叶绿体以得到叶绿体基质蛋白和膜蛋白。经Brmldford法测定,其蛋白含量相对较高。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分离上述蛋白。结果表明：在所得蛋白条带中发现有许多不同的条带,预示着分步顺序提取法的有效性和叶绿体各部分蛋白存在的差异性。此外除得到叶绿体成分外,还发现一些高密度成分（尚未鉴定）。对如何分离完整叶绿体进行了较为详细的讨论。     

橡胶草叶片蛋白质提取方法的选择及双向电泳体系的优化

目的为了建立起橡胶草叶片组织的蛋白双向电泳体系。方法采用5种不同方法提取橡胶草叶片蛋白,并通过蛋白提取率和单向SDS-PAGE电泳的比较,筛选出改良TCA-丙酮沉淀法、酚-乙酸铵沉淀法、Tris浸提法3种方法进行2-DE电泳。结果表明选择改良TCA-丙酮法为最合适的蛋白质提取方法。为进一步优化体系,比较了不同染色方法、上样量和固相p H梯度预制胶条(IPG)的p H范围对双向电泳结果的影响,电泳结果表明使用17 cm p H 3-10的IPG胶条、上样量为1200μg、考马斯亮蓝染色法能分离得到更多的蛋白点,是橡胶草叶片双向电泳体系的最优条件。结论本研究初步建立了橡胶草叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究橡胶草蛋白质组学提供依据。     

甘蔗叶片蛋白质组双向电泳技术优化

为了建立适合甘蔗叶片蛋白质组研究的双向电泳技术,对甘蔗叶蛋白质的溶解方法、IEF电泳、上样量等关键步骤进行了优化.结果表明:裂解液中有2 mmol/L的硫脲才能更充分地溶解蛋白;上样量1.0 mg时得到质量较好的凝胶图谱;甘蔗叶片蛋白质主要分布在pH4～7范围.通过对甘蔗叶片蛋白双向电泳技术的优化,提高了双向电泳图谱分...     

影响双向电泳分离效果的若干实验条件比较研究

对第一向为载体两性电解质pH梯度等电聚焦双向电泳(ISO-DALT)中若干影响分离效果的实验条件进行了研究.结果发现,琼脂糖和尿素的纯度明显影响分离效果;加丙烯酰胺或碘乙酰胺保护经二硫苏糖醇还原的样品中的巯基,可以显著减少假斑点;厚度较薄的分离胶的分离效果较好;以琼脂糖为两性电解质载体代替聚丙烯酰胺的第一向等电聚焦电泳使分子量105Da以上蛋白质得以分离.     

一种高效纯化血清淀粉样物质A(SAA)的方法

通过密度梯度超速离心、脱脂从急性相胸水中分离得到含有血清淀粉样物质A（Serum AmyloidA,SAA）的高密度脂蛋白（HDL），再通过两次Sephacry1S-200层析纯化SAA蛋白。经SDS-PAGE电泳和Western Blotting检验证实得到的SAA蛋白纯度高，可作为抗原免疫动物制备抗体，方法可用于从胸水中大量制备SAA。     

日本脑炎病毒受体功能缺陷细胞与亲代细胞膜分子差异的鉴定

鉴定日本脑炎病毒（JEV）受体功能缺陷细胞3A10-3F与亲代细胞BHK-21膜分子表达的差异,以发现JEV受体候选分子。3A10-3F与BHK-21细胞膜蛋白用氯仿去脂法分别提取,通过二维电泳（2-DE）分离。经ImageMaster2D软件分析比较后,选取差异点做液质联用质谱分析（LC—MS／MS）。发现有23个蛋白点在两组2-DE凝胶中有显著差异表达,LC-MS／MS鉴定了14个蛋白质,其中有4个膜蛋白,即钙结合蛋白annexin1,annexin2;电压依赖的离子通道（VDACs）蛋白VDAC1,VDAC2。上述结果为深入鉴定JEV受体分子特性与功能,阐明JEV致病机理提供了线索。     

蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术

在当今生命科学研究的热门领域蛋白质组学研究中,双向电泳技术是分离检测细胞、细胞系、器官和组织的总蛋白质组的最有效的方法.双向电泳技术是根据蛋白质等电点和分子量两个相互独立的参数,在相互垂直的两个方向进行二次电泳的过程,其主要步骤包括样品制备、电泳、凝胶染色和图像分析.本文就双向电泳的步骤、技术特点、缺陷和发展前景进行简述.     

人类绒毛膜促性腺激素（HCG）的高分辨双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

采用高分辨的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D—PAGE)对人类绒毛膜促性腺激素(~bCG)进行分析。第一向等电点聚焦电泳(IEF)后,在第二向SDS—聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直板上电泳(SDS)—PAGE),电泳结束,用银染色法染色,电泳图谱上得到三条主要的蛋白区带,即A,B和C带,并测定了它们的pH值和分子量,A带分子量是36K为未裂解的~hCG,B带分子量是23K为~hCG的β—基亚,C带分子量是17K为~hCG的α—亚基,通过双向电泳的分析和鉴定,为~hCG的分子结构在双向电泳中的特性提供了初步参考数据。     

适用于小麦叶片总蛋白分析的双向电泳技术

双向电泳技术越来越成为植物蛋白质组研究中的关键技术,样品制备、固相预制胶条水化、等电聚焦及SDS—PAGE都是影响双向电泳结果的重要步骤,本研究以晋麦47号小麦叶片为研究材料,在样品除盐、预制胶条水化方式、第二向SDS—PAGE电压选择方面进行了探索与优化,通过比较双向电泳图谱,建立适用于小麦叶片总蛋白质分析的双向电泳技术体系．结果表明：样品经多步除盐并加长除盐时间后进行双向电泳,蛋白能较好地被分离,2-DE图谱蛋白点较多,分辨率较高;IPG胶条先后经被动水化与主动水化比仅主动水化的2-DE图谱蛋白点损失少;第二向SDS—PAGE中电压选择120V较200V的2．DE图谱蛋白点拖尾少,纹理现象少．     

Proteomic analysis of long-term salinity stress-responsive proteins in Thellungiella halophila leaves

Salinity is one of the most severe environmental factors that may impair crop productivity. A proteomic study based on two-dimensional gel electrophoresis is performed in order to analyze the long-term salinity stress response of Thellungiella halophila, an Arabidopsis-related halophyte. Four-week-old seedlings are exposed to long-term salinity treatment. The total crude proteins are extracted from leaf blades, separated by 2-DE, stained with Coomassie Brilliant Blue, and differentially displayed spots are identified by MALDI-TOF MS or QTOF MS/MS. Among 900 protein spots reproducibly detected on each gel, 30 spots exhibit significant change and some of them are identified. The identified proteins include not only some previously characterized stress-responsive proteins such as TIR-NBS-LRR class disease resistance protein, ferritin-1, and pathogenesis-related protein 5, but also some proteins related to energy pathway, metabolism, RNA processing and protein degradation, as well as proteins with unknown functions. The possible functions of these proteins in salinity tolerance of T. halophila are discussed and it is suggested that the long-term salinity tolerance of T. halophila is achieved, at least partly, by enhancing defense system, adjusting energy and metabolic pathway and maintaining RNA structure.     

Proteomic analysis of long-term salinity stress-responsive proteins in <Emphasis Type="Italic">Thellungiella halophila</Emphasis> leaves

Salinity is one of the most severe environmental factors that may impair crop productivity. A proteomic study based on two-dimensional gel electrophoresis is performed in order to analyze the long-term salinity stress response of Thellungiella halophila, an Arabidopsis-related halophyte. Four-week-old seedlings are exposed to long-term salinity treatment. The total crude proteins are extracted from leaf blades, separated by 2-DE, stained with Coomassie Brilliant Blue, and differentially displayed spots are identified by MALDI-TOF MS or QTOF MS/MS. Among 900 protein spots reproducibly detected on each gel, 30 spots exhibit significant change and some of them are identified. The identified proteins include not only some previously characterized stress-responsive proteins such as TIR-NBS-LRR class disease resistance protein, ferritin-1, and pathogenesis-related protein 5, but also some proteins related to energy pathway, metabolism, RNA processing and protein degradation, as well as proteins with unknown functions. The possible functions of these proteins in salinity tolerance of T. halophila are discussed and it is suggested that the long-term salinity tolerance of T. halophila is achieved, at least partly, by enhancing defense system, adjusting energy and metabolic pathway and maintaining RNA structure.     

补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证“方证相关”的蛋白质组学研究

揭示补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证"方证相关"的现代生物学基础,制作高血压病气虚血瘀证细胞模型。用补阳还五汤含药血清干预细胞模型,利用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)技术筛选及鉴定差异表达的蛋白点。并对其进行生物学分析。结果高血压病气虚血瘀证组与健康对照组比较,差异蛋白质点有30个。其中,有16个蛋白上调,14个蛋白质下调。补阳还五汤组与高血压病气虚血瘀证组比较,差异蛋白质点有14个。其中,有9个蛋白上调,5个蛋白质下调。MALDI-TOF-MS/MS鉴定出:高血压病气虚血瘀证组与健康对照组差异蛋白点共有8个蛋白被成功鉴定出来。表达上调的蛋白有肽基脯氨酰异构酶A、肽基脯氨酸顺反异构酶A样1亚型、真核翻译起始因子5A-1 B亚型、微管蛋白beta-2C、CRA_b亚型、3-羟酰辅酶A脱氢酶2型异构体2。表达下调的蛋白有丙酮酸激酶同工酶M1亚型、抑制蛋白-1、抑制蛋白-1 1亚型、补阳还五汤组与高血压病气虚血瘀证组差异蛋白点共有3个蛋白被成功鉴定出来。表达上调的蛋白有丙酮酸激酶CRA_c亚型、热休克蛋白27;表达下调的蛋白有膜联蛋白A1,CRA_b亚型。这些蛋白多与促进或抑制细胞凋亡有关。说明高血压病气虚血瘀证存在着细胞凋亡,补阳还五汤可以纠正高血压病气虚血瘀证引起的细胞凋亡。这些差异蛋白可以作为高血压病气虚血瘀证的标志蛋白或补阳还五汤的作用靶点,抑制细胞凋亡可能是补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证"方证相关"的现代生物学基础之一。     

巴西橡胶树树皮蛋白质组学分析体系的构建

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,其体内合成和贮存胶乳的地方是乳管系统,而乳管主要分布于树皮中。以10年生巴西橡胶树无性系“热研88-13”为研究对象,采用改进的三氯乙酸(TCA) 丙酮沉淀法提取树皮蛋白,使用17 cm,pH 4~7的IPG胶条进行双向电泳,得到良好的蛋白图谱。PDQuest软件(Bio rad)分析银染后的凝胶,共得到约350个蛋白点。从这些蛋白点中随机选取10个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库对蛋白进行鉴定。结果显示,这些蛋白主要包括两种来源于巴西橡胶树中的重要蛋白,即橡胶小粒子蛋白(Small rubber particle protein)和橡胶树凝集因子(hevein),此外还有一些其他功能和未知功能的蛋白。     

小麦灌浆期籽粒粒重差异的代谢蛋白质组学初步研究

高粒重（48号）和低粒重（154号）小麦株系是01-35（大粒）和6044（小粒、多穗）的稳定杂交后代,具有相似的遗传背景.取灌浆期（开花后17天）的小麦籽粒,提取代谢蛋白,双向电泳后,进行图谱分析.结果显示：两品系中分别鉴定了380和367个蛋白点,其中52个蛋白点为两品系差异显著性表达.将其中13个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionizaton time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）进行了肽质指纹图分析,通过采用Mascot软件对MSDB数据库查询,其中9个蛋白质点得到了鉴定,包括葡聚糖合成酶、葡萄糖-1-磷酸-腺苷转移酶小亚基前体、一种胚胎晚期富集蛋白等.本研究初步建立了小麦籽粒灌浆其代谢蛋白蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）方法,通过质谱分析、数据库搜索的结果对粒重形成的机制进行了探讨,并对以后的研究工作提出了改进方案.     

Two-dimensional gel electrophoresis analysis of the proteomes expressed in the human hepatoma cell line BEL-7404 and normal liver cell line L-02

Proteome analysis technology has been used extensively in conducting discovery research of biology and has become one of the most essential technologies in functional genomics. The proteomes of the human hepatoma cell line BEL-7404 and the normal human liver cell line L-02 have been separated by high resolution two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) with immobilized pH gradient isoelectric focusing (IPG-IEF) in the first dimension and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in the second dimension (IPG-DALT). The resulting images have been analyzed using 2-D analysis software. Quantitative analysis reveals that 7 protein spots are detected only in hepatoma BEL-7404 cells, 14 only in L-02 cells, and 78 protein spots show significant fluctuation in quantity in both cell lines (P< 0.01). These protein spots have been displayed on a proteome differential expression map. Analysis for the reproducibility of 2-DE indicates that the positional variability in the IEF dimension is 0.73 mm, while the variability in the SDS-PAGE dimension is 0.44 mm, and the quantitative variability is 17.6%–19.2%. These results suggest that the reproducibility of 2-DE has been suitable for the study of differential expression of proteomes. Proteome differential expression maps can be useful tools for disease diagnosis, drug-target validation analysis and biological process elucidation.     

对B.t毒素敏感与抗性的昆虫细胞的差异蛋白质肽质指纹分析

采用2-DE技术分析了粉纹夜蛾TnH5对B.t CrglAC毒素敏感和抗性2种细胞总蛋白质,建立了TnH5细胞双向电泳图谱,获得了一些差异蛋白质.对部分差异蛋白质点采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)测定了其胶内酶解后的肽质指纹图谱(PMF),查询数据库,结果表明,部分差异斑点分别与胞质外周蛋白、脂多糖生物合成蛋白、一种脱氢酶和类免疫球蛋白等类似.     

金钗石斛花芽蛋白质提取及其双向电泳体系优化

通过对蛋白质提取方法、水化方式、等点聚焦程序、IPG胶条选择等方面的优化,建立金钗石斛花芽蛋白质双向电泳体系.结果表明,采用酚抽提法提取蛋白,样品与水化液1∶〖KG-*2/3〗40复溶;被动水化,等点聚焦程序B2;选用24 cm pH 3～10NL 胶条和12% 的凝胶;采用考马斯亮蓝G-250染色,获得了可识别1 422个蛋白质斑点的双向电泳图谱,且重复性好、分辨率高,为进一步开展金钗石斛花芽在蛋白质组学水平上的分析提供了技术支持.     

DMSO处理后中国仓鼠卵巢细胞的蛋白质组变化分析

在培养基中添加二甲基亚砜(DMSO)可使基因工程中国仓鼠卵巢细胞(CHO)外源蛋白乙肝表面抗原(HBsAg)的比生产速率提高4倍以上.为了进一步研究DMSO的作用机理,采用双相凝胶电泳技术分离在培养基中添加1.5%的DMSO后CHO细胞的总蛋白,胶态考马斯亮蓝G-250染色,GS-800凝胶扫描仪获取凝胶图像,并用PDQUEST软件分析,测得每张图谱平均斑点数量为1852±123,以其中一块胶为参考胶进行4块胶间的斑点匹配,其平均匹配的点数达1326±100,平均匹配率为71.6%以上.通过分析得到18个蛋白质点在添加了DMSO后表达量有明显变化(其中12个蛋白表达量明显降低,6个蛋白表达量明显增加.用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹谱图和串级质谱图,用GPS软件查询NCBI数据库进行了鉴定.鉴定结果表明,这些差异蛋白中一些是与细胞周期有关的蛋白,一些是与细胞能量代谢相关的蛋白,还有一些是与蛋白翻译后修饰有关的酶,这些结果进一步深化了对DMSO提高CHO细胞表达HBsAg的机理的理解.     

莽山烙铁头蛇粗毒双向凝胶电泳分析

采用固相pH梯度等电点聚焦-SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对莽山烙铁头粗毒进行了分析,通过银染法显色,电脑软件识别出约40个蛋白质点.其中分子量超过130 kD的蛋白质点很少,分子量90 kD~10 kD的区域均有蛋白质点分布,分子量34 kD区域的蛋白质点较为密集,且它们的含量明显较高.从蛋白质点的等电点分布范围分析,偏于碱性端的蛋白质明显多于酸性端的蛋白质,且分布在中性偏碱(pH 7~8)的区域.质谱数据的数据库搜寻结果表明:莽山烙铁头蛇毒中含有类凝血酶组分、纤溶酶组分、血小板聚集蛋白、抗血小板聚集蛋白和平滑肌钙离子通道阻断剂等组分.