人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

大鼠促红细胞生成素受体基因克隆及其在颅脑损伤模型中的表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆大鼠促红细胞生成素受体基因.该基因ORF区全长1 524bp,编码507个氨基酸,推测其相对分子质量为55.48ku,等电点5.07.实时荧光定量PCR结果显示:大鼠早期颅脑损伤中,EPOR基因表达呈逐步上升趋势,颅脑损伤后24h表达量达到顶峰,为对照组的6倍.     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。     

重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

人血小板生成素在COS－7细胞中的暂时表达

利用反转录ＰＣＲ获得的全长人ＴＰＯｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的Ｎｈｅｌ位点，用ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法将其导入ＣＯＳ-７细胞中．实验表明，所构建的表达质粒在ＣＯＳ-７细胞中有转录水平表达．ｈＴＰＯ在真核系统中的稳定表达正在研究中．     

红细胞生成素(EPO)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中稳定表达

将ＥＰＯｃＤＮＡ分别插入真核表达质粒载体ｐＳＶ２ｄｈｆｒ和ｐｃＤＮＡ３的适当位点,用电脉冲法导入ＣＨＯ细胞,用ＥＬＩＳＡ法检测ＥＰＯ的表达量,用ＴＦ１细胞检测ＥＰＯ表达产物的生物活性．结果表明,用ｐＳＶ２ｄｈｆｒ作为载体,在抗ＭＴＸ阳性细胞克隆中,获得了表达ＥＰＯ（２５８ｎｇ／ｍＬ培养液）的ＣＨＯ细胞株,并且表达产物具有生物活性．进一步的传代和冻存试验表明,所得细胞株表达ＥＰＯ的水平不受传代和冻存的影响     

红细胞生成素在急性肾功能衰竭中的变化

该研究经较严密的设计，采用敏感及特异的检测方法——双抗体酶联免疫法测定血清EPO水平。选择原发病不引起贫血，呼吸功能正常的病例作研究，并对中毒性ARF作了专门研究。结果显示，ARF能引起血清EPO下降，随后产生明显的贫血。从而提示，ARF本身的贫血与EPO下降有关，并为EPO治疗ARF贫血提供理论依据。     

人源雄激素受体DNA结合结构域的原核表达与其响应元件的复合物结晶

为获得高分辨率的雄激素受体与其响应元件的复合物晶体结构,为前列腺癌的治疗提供药物靶点设计的理论基础.本研究构建了AR-DBD的原核表达载体,在0.5 mmol/L IPTG,16℃条件下诱导24 h表达该蛋白.通过与AR响应元件寡核酸的结合优化蛋白纯化条件,使AR-DBD蛋白易于纯化.最终,蛋白核酸复合物晶体呈现出边缘清晰,短棒状的立体结构,本研究制备的蛋白核酸复合物晶体可直接用于X射线衍射分析.     

鼠心钠素基因在大肠杆菌中的融合表达及产物的分离纯化

将克隆有化学成分的鼠心钠素基因的质粒ＰＸＺ－ａ－ＡＮＰ－５９０改建成质粒ＰＬＨ２８０,转化大肠杆菌表达融合蛋白ＬａｃＺ－２８０－ａ－ＡＮＰ。     

氨对重组中国仓鼠卵巢细胞生长及人红细胞生成素表达的影响

氨对重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的生长具有明显的抑制作用，并遵循二级抑制模型，抑制常数Ka为41．5（mmol/L)^2，即当氨浓度为6．45mmol/L时，细胞的比生长速率下降到最大比生长速率的50％，在重组CHO细胞的批培养过程中，细胞密度和红细胞生成素浓度随着起始氨浓度的提高而下降，但存在一最适的氨浓度，在此浓度下，单位重组CHO细胞的EPO比生成速率最大。     

融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化

为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素(PED),按照美国国立生物技术信息中心公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌基因组DNA为模板,用多聚酶链式反应扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合PED的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21(DE3).在异丙基硫代半乳糖苷诱导后融合蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28%.经镍亲合层析纯化的融合蛋白用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率.融合蛋白没有抗粪肠球菌细菌素活性,被分开的PED恢复了抑菌活性.     

人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高产表达人表皮生长因子（hEGF），并探索提高外源基因在pET-3c：BL（DE3）表达系统的表达水平的途径。方法：根据大肠杆菌对密码的偏爱性，合成编码53个氨基酸的hEGF基因，分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达。计算机两者mRNA的翻译起始区（translation initiation region，TIR）的结构。结果：融合蛋白表达产量为27％，非融合蛋白的表达用SDS－PAGE检测不到，两者均具有促细胞增殖的活性。融合蛋白mRNA的TIR的△G值较非融合蛋白的高。结论：在pET－3c：BL21（DE3）大肠杆菌表达系统中，以融合蛋白方式表达人表皮生长因子，表达效率高且不影响其活性，此外，mRNA的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素。     

人血小板生成素在COS—7细胞中的暂时表达

利用反转录ＰＣＲ获得的全长人ＴＰＯ ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的ＮｈｅＩ位点，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法将其导入ＣＯＳ－７细胞中。。实验表明，所构建的表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中转录水平表达，ｈＴＰＯ在真核系统中的稳定表达正在研究中。     

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b( )构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中获得高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x构建了融合表达载体并进行了表达。结果融合表达可获得可溶性蛋白,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。