大鼠HPRT基因敲除载体的构建

根据已知大鼠HPRT基因的外显子序列,从大鼠HPRT基因BAC中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的3.0kb和1.7kb的长臂(LongArm,LA)和短臂(ShortArm,SA),并克隆到pSL1180和pKO中.3.0kb长臂片段包含5′端部分序列和exon1部分序列,1.7kb短臂位于exon6和exon7之间.依次将neor、SA、LA克隆到pBS相应酶切位点,得到pBS-HPRT,再将LA-neor-SA片段由pBS中切出,克隆到pKO的KpnI和NotI位点之间,得到大鼠HPRT基因敲除载体pKO-HPRT.     

SD大鼠的剖腹净化

1994年从日本引进的SD大鼠种群 ,本身携带有金黄色葡萄球菌 ,不符合我国SPF动物的等级要求 ,为使之符合我国三级动物的要求 ,通过剖腹产手术进行净化 ,并用SPFWistar大鼠为保姆代乳。成功剖腹孕鼠 35只 ,选取活仔 115只 (每只母鼠选仔 4— 6只 ) ,经过扩大繁殖 ,目前已为 180只生产母鼠 ,4 0只生产雄鼠的生产群。经过 4年共18次的微生物检测 ,不但去除了金黄色葡萄球菌 ,而且 ,各项微生物检测指标均符合我国SPF大鼠的等级标准。表明剖腹净化是成功的     

Faim2基因敲除增加小鼠心肌肥厚

目的 建立Fas凋亡抑制分子2(Faim2)基因敲除小鼠,评价Faim2基因敲除对于小鼠主动脉弓缩窄(TAC)手术诱导的病理性心肌肥厚的影响。方法 构建Faim2敲除的品系小鼠并繁殖,用PCR法和Western blot鉴定基因型;用主动脉弓缩窄手术建立小鼠心肌肥厚模型,并用苏木精-伊红以及天狼星红染色检测Faim2基因敲除对于小鼠心肌肥厚的影响。结果 Faim2基因敲除小鼠的构建与繁殖均获得成功,Faim2基因敲除对于小鼠病理性心肌肥厚有促进的作用。结论 Faim2基因敲除加重小鼠病理性心肌肥厚。     

条件性基因敲除动物及其在毒理学研究领域的应用进展

动物实验是毒理学研究中的重要手段和核心内容。传统的基因敲除动物在胚胎致死性基因研究方面具有一定局限性。条件性基因敲除动物在克服传统基因敲除动物缺陷的情况下,为更深、更广的毒理学研究提供了重要工具。本文将从条件性基因敲除技术的原理及条件性基因敲除动物在毒理学领域中的应用进展两方面来进行综述。     

RELM-β基因敲除大鼠的繁育及基因型鉴定

目的 探讨抵抗素样分子β(RELM-β)基因敲除大鼠的最优繁育方式和基因型鉴定方法。方法 将RELM-β^-/-纯合子雌性Sprague Dawley(SD)大鼠和野生型雄性Wild type(WT)SD大鼠按2∶1交配，繁育出F1杂合子大鼠，采用RELM-β^-/-纯合子互交、RELM-β^+/-杂合子互交、纯合子及杂合子互交(正交及反交)4种方式交配，PCR扩增凝胶电泳法鉴定子代大鼠基因型，观察子代大鼠的外形，统计子代大鼠数量、体质量及纯合率。结果 PCR扩增凝胶电泳法成功鉴定亲代及子代大鼠的基因型，3种基因型大鼠的外观形态无明显差异，3周至6周龄大鼠体质量无明显差异，不同交配方式子代数量无明显差异。结论 合理的繁殖方法并进行正确的鉴定是获得RELM-β基因敲除SD大鼠的重要途径，PCR扩增凝胶电泳法具有快速、经济，重复性较好的优点。     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

eEF1A2敲除对小鼠骨骼肌组成的影响

目的 探究真核细胞翻译延长因子1-α2 (eEF1A2)缺失对小鼠骨骼肌的含量和组成的改变。方法 12月龄的eef1a2^fl/fl;CreER^T2+小鼠(iHBKO)及其对照eef1a2^fl/fl;CreER^T2-小鼠(Control)分别连续3 d腹腔注射30 mg/kg他莫昔芬,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot验证小鼠骨骼肌eEF1A2敲除效率,利用HE染色检测小鼠骨骼肌形态,qRT-PCR检测小鼠骨骼肌主要纤维类型标志物的表达变化。结果 与对照组小鼠相比,iHBKO小鼠骨骼肌实现了eEF1A2的高效敲除。敲除小鼠腓肠肌脏器系数下降,但腓肠肌形态及横截面积无明显变化。eEF1A2基因敲除还导致快肌腓肠肌和趾长伸肌中慢肌标志物肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7,Myh7)表达明显升高,快肌标志物肌球蛋白重链4(myosin heavy chain 4,Myh4)明显降低,而慢肌比目鱼肌和胫骨前肌的Myh4和Myh7显著降低。结论 eEF1A2...     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构，明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能，选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间，设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上，利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况，鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系，敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础，同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

小鼠基因敲除的研究进展

随着人类基因组计划(HGP)的顺利完成,后基因时代的生物学研究迫切需要一种有效的基因功能分析方法。基因敲除小鼠模型的应用,为研究基因的功能和寻找新的治疗人类疾病的干预措施提供了有力支持。基因打靶和基因捕获是两种不同的通过胚胎干细胞(ES细胞)制作基因敲除小鼠的技术。基因捕获具有高通量、随机性、序列标记等特点,而基因打靶则是针对特定基因的敲除。自基因打靶和基因捕获小鼠首次亮相距今已有近20年的时间。近年来,针对基因打靶和基因捕获的新工具不断涌现,并且相应的组织也已经成立。这些组织能够利用这两种方法敲除小鼠基因组中的基因。国际基因捕获协会(The International Gene Trap Consortium,IGTC)和基因敲除小鼠计划(The Knockout Mouse Project,KOMP)已着手创建世界范围内用于科研的便利资源,并且计划敲除所有小鼠的基因。KOMP的组织者认为这与HGP一样具有重要意义。从传统的基因打靶到现在的高通量的条件基因打靶,基因打靶的方法已经发生了很大的变化。捕获和打靶两者的组合优势大大提升了基因捕获的范围和基因打靶的效率。作为一种新开发的插入式突变系统,转座子在捕获基因方面比逆转录病毒更具有优势。国际基因敲除小鼠协会(The International Knockout Mouse Consortium,IKMC)的出现标志着全球性合作的开始。该组织致力于系统地敲除小鼠基因组中所有基因,进而开展功能基因组的研究。     

实验鼠的剖腹产代乳净化

实验动物的生物净化方法主要有药物净化和剖腹产净化两种，一般要得到较高级别的实验动物主要是通过剖腹产净化的方法达到，目前国内多采用手术隔离器进行剖腹产手术，笔者利用北京实验动物研究中心的悉生工程设备，以澳大利亚引进的无菌ＮＩＨ小鼠和ＳＤ大鼠作为代乳鼠，分别对来自美国的清洁级ＮＩＨ小鼠和来自澳大利亚的清洁级ＳＤ大鼠首次进行了在超净工作中做剖腹产手术的尝试。     

舒芬太尼在腰硬联合麻醉下剖腹产术后硬膜外镇痛中的应用

目的:观察舒芬太尼复合布比卡因应用于腰硬联合麻醉下剖腹产术后自控硬膜外镇痛的效果及对并发症的影响。方法:对60例剖腹产患者分别采取两种硬膜外术后镇痛方法,观察并比较其效果。结果:两组各时段有效按压次数比较,舒芬太尼组(S组)明显少于芬太尼组(F组)。S组的VAS评分在12 h,24 h明显低于F组(P<0.05);S组的BCS评分和Ram评分也明显高于F组(P<0.05)。S组的并发症低于F组,两组病人SPO2均保持95%以上,两组HR比较无明显差异。结论:舒芬太尼联合布比卡因以及地塞米松,效果明显高于芬太尼组,而且并发症也很少发生。应用于腰硬联合麻醉后的硬膜外自控镇痛是安全可行的。     

雌性Akt2基因缺失小鼠生殖表型研究

通过对雌性Akt2 基因敲除纯合子小鼠(Akt2(-/-))及野生型小鼠(Akt2(+/+))基础指标、大体形态学指标、血清糖脂水平和性激素水平等方面的评估,探讨Akt2基因缺失对糖脂代谢和卵巢功能影响.雌性Akt2(+/+)及Akt2(-/-)小鼠各16只,行口服糖耐量(OGTT)实验(2mg/kg),阴道涂片监测动情周期,于动情间期进行动力学实验,将纯合子和野生型小鼠分别随机分为空白组和刺激组2组,刺激组予HMG(人绝经期尿促性激素)(0.5IU/g)刺激2h,空白组予等体积的生理盐水刺激2h,检测各组小鼠体重、体内脂肪重量、血脂、空腹胰岛素水平和生殖激素水平,卵巢常规病理检测各组小鼠卵巢形态学变化.结果发现,同野生型小鼠相比,纯合子小鼠动情周期显着延长(P<0.05),随机血糖、0h血糖、2h血糖、空腹胰岛素水平和HOMA指数均显著升高(P<0.05),而血清甘油三醑(TG)水平则显著降低(P<0.05);性激素检测发现纯合子小鼠血清17羟孕酮(17-OHP)、雌二醇(E2)、△17-OHP、△E2均显着升高.综上,本文认为Akt2基因不仅可以影响机体糖脂代谢,同时也影响卵巢功能,说明胰岛素调节糖代谢的关键信号分子对卵巢生殖功能同样具有重要的调节作用.     

实验用大白鼠蛲虫感染状况调查

目的:了解某高校实验动物大白鼠蛲虫感染情况,为医学实验提供符合标准的实验动物。方法:按照国家标准《实验动物寄生虫学》检测方法,用粪便生理盐水涂片法检查。结果:共检测1月龄、2月龄大白鼠69只,其中感染蛲虫鼠17只,阳性率25%。结论:为确保实验动物质量,应定期对动物进行寄生虫学检测,以保障实验人员安全,保证实验的可信度、严谨性。     

林可霉素生物合成基因lmbU的敲除及其遗传回补

利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensis NRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensis JLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力.利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成能力.单一回补下游基因lmbY和lmbX不能使缺陷株重新恢复林可霉素合成能力;而同时回补lmbU基因和下游基因lmbY和lmbX却能回补这种缺陷,缺陷株林可霉素合成能力的丧失不仅是由下游基因的破坏而引起,证实了lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因.根据不同重组质粒上装载的基因片段性质推测了lmbU基因可能的启动子.     

Al2O3-CaO-SiO2系截面图的计算与验证

以实测相图为依据选择溶液的基本相,采用FACT软件计算了复杂的Al2O3-CaO-SiO2三元氧化物体系的两个等温截面和两个多温截面,并根据实测相图绘制了同等条件下的截面图,对其进行验证分析.结果表明,由于Al2O3-CaO-SiO2三元系化合物数量多,结构复杂,计算相图与实测相图相差较大.在用FACT软件计算组元间相互作用较强的氧化物体系相图时,尚需进一步改进计算模型,完善热力学数据库.存在强相互作用的三元氧化物体系的等温截面和多温截面应以实验数据为基础,同时参考计算相图.     

用修正学习曲线测算井段的钻井时间

将学习曲线与传统的分段方法结合起来,既克服了分段法中不考虑学习效果的缺陷,又克报了学习曲线中不能灵活调整的缺陷,形成两种方法的优点叠加．用学习曲线测算井段的钻井时间,其前提条件是：各井在该井段的钻头选型基本相同,井段直径相同,所穿过的地层相同,所属的井型相同．对钻井参数（钻压、转速、泵压、排量）、泥浆密度与性能、喷嘴直径与个数等时变性因素,不单独列出,而作为在钻井过程中通过逐步学习加以改善的对象．用塔北某地区１号构造上所钻井的二开井段（４４４．５ｍｍ）实际资料测算,得到的结果明显优于钻井监督的计划时间,测算的最大相对误差１１．８％,平均为８．８％,而监督组计划误差为４１．９％,平均误差率降低了一半以上．     

KM小鼠剖腹产手术中福利保障对仔鼠的影响

目的评估KM小鼠剖腹产手术中动物福利保障方案。方法通过在KM小鼠剖腹产手术中采用A、B两组不同动物福利保障方案,观察其对剖产仔鼠只数、10 d存活率、离乳体质量和离乳率的影响。结果 B组较A组仔鼠体质量增大,10 d存活率和离乳率显著提高。结论剖腹产手术中的动物福利保障,可提高仔鼠体质量增长速度、仔鼠存活率和离乳率。     

实验大鼠和小鼠多种病毒的血清学检测结果分析

摘要:目的　评估近期大鼠和小鼠的病毒感染情况,为我国大、小鼠质量控制和标准化提供参考。 方法　应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对2012年至2013年国内36家单位送检的小鼠和大鼠血清进行病毒抗体检测,检测出现阳性的样品再用免疫荧光试验(IFA)进行复检。 结果　检测小鼠病毒抗体18项,出现阳性结果的有9项,小鼠诺如病毒和小鼠肝炎病毒阳性率最高,分别是42.2％和19.9％,检测大鼠病毒抗体14项,出现阳性结果的有8项,大鼠细小病毒有5项,阳性率最高达13.6％—34.4％。 结论　我国大、小鼠病毒监测、净化和控制工作仍需加强。     

Presenilins条件性双基因敲除小鼠海马与皮层超微结构的增龄性变化

为研究Presenilins条件性双基因敲除对于小鼠海马与皮层超微结构的影响,选用3、6及12月龄Presenilins 1/Presenilins 2双敲除小鼠(dKO)和同窝对照小鼠(CON),运用透射电子显微镜技术,分别观察海马与皮层突触、细胞核、线粒体、溶酶体超微结构的改变.结果发现:3月龄dKO小鼠海马与皮层溶酶体已向次级溶酶体转化.6月龄dKO小鼠海马与皮层的突触后致密物厚度显著降低;皮层细胞核膜内陷,核不规则;海马与皮层线粒体出现肿胀、嵴变形或消失;出现高电子密度的次级溶酶体,并伴有脂褐素小体出现.12月龄dKO小鼠海马与皮层突触后致密物厚度显著减小,突触间隙宽度显著增加;海马与皮层核膜内陷,染色质固缩沿核膜分布;线粒体严重受损,嵴大部分溶解;出现较多次级溶酶体和脂褐素小体.Presenilins条件性双基因敲除对小鼠海马与皮层有增龄性的病理影响,这些病理改变将为相关的药物评价和对阿尔茨海默病的深入研究提供形态学依据.