人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的

应用等温多自配引发扩增（IMSA）技术, 分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物, 并在检测体系中加入羟基萘酚蓝（HNB）和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂, 建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法. 结果表明： 340 μmol/L HNB与1∶10 000 SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果, 455 nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色, 阴性反应管双荧光显色为橘红色; 该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL, 可特异性检出样品中HPV16和HPV52, 与临床检测结果比对无差异.     

人16型乳头瘤病毒"假病毒"的制备

利用杆状病毒表达体系,在sf9细胞中表达人16型乳头瘤病毒(Human Papillomavirus type 16, HPV16)的晚期表达蛋白L1,通过超速离心的方法得到HPV16病毒样颗粒(virus like particles, VLPs).VLPs经过DTT和EDTA处理解聚成L1蛋白,将构建好的真核表达载体E6E7-pcDNA3.1 与解聚的L1蛋白混合,透析除去DTT和EDTA并逐渐升高Ca2 的浓度,解聚的L1能够重新聚集成VLPs,其中一部分VLPs包裹了真核表达载体,和天然的人乳头瘤病毒的构成很相似,作者称之为"假病毒".     

应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

目的 应用液态悬浮芯片技术,建立一种新的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法.方法 应用通用引物从HPV基因组中扩增出目的片断,与13型荧光微球偶联探针杂交,通过LuminexTM100检测HPV的型别.结果 检测十三型标准株质粒,对单一标准品和混合标准品均可准确分型.结论 初步建立了高通量、快速、可靠、适用于临床的人乳头瘤病毒分型基因诊断方法.     

快速敏捷检测人乳头瘤病毒基因型的实时荧光PCR方法

宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关.采用实时荧光PCR技术对引起宫颈癌的两种主要HPV亚型HPV16和18型阳性质粒进行检测,在实验室中成功构建了HPV16和18型的检测体系以及体外模拟的双重感染检测体系,并对三例临床确诊为宫颈癌的标本进行实时荧光PCR验证检测,确定三例标本均为高浓度HPV16型感染,极易引起宫颈癌变,与医院诊断结果相符合.本实验为实时荧光PCR技术检测HPV16和18型的临床检验在实验室中成功地进行了探索,为实时荧光PCR技术在宫颈癌大规模筛查上的应用提供了研究基础.     

荧光定量PCR法在人类宫颈癌RNA干扰中的应用

研究荧光定量PCR法在RNA干扰（RNAi）技术抑制宫颈癌Caski细胞人乳头瘤病毒16型E6基因（HPV16E6）的应用情况,并与传统使用的灰度值分析法进行比较。构建shRNA重组质粒干扰载体转染至Caski细胞中。通过荧光定量PCR法和灰度值分析法检测干扰后细胞HPV16E6基因的mRNA及蛋白质表达水平。实验表明HPV16E6基因mRNA及蛋白质的表达量都有明显降低,与阴性对照空白质粒组相比有显著差异（P〈0．01）;RNAi对宫颈癌Caski细胞中HPV16E6基因的表达具有较高的抑制率;荧光定量PCR法较之传统的灰度值分析法更为准确。     

兰州市膀胱移形细胞癌尿脱落细胞HPV感染基因型调查研究

目的:调查兰州市膀胱移形细胞癌尿脱落细胞HPV型感染率及其主要基因型,进行乳头瘤病毒与膀胱癌移形细胞癌发生发展相关性研究.方法:采用聚合酶链式反应方法(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测了200例膀胱移形细胞癌尿脱落细胞中人类乳头瘤病毒的感染情况.结果:膀胱移形细胞癌尿脱落细胞中HPV6、11、16、18型阳性率分别为7.9%、6.3%、36.9%和7%,低危型人类乳头瘤病毒6、11型阳性率为11.3%,高危型人类乳头瘤病毒16、18型阳性率为37%.人类乳头瘤病毒6、11、16、18型感染阳性率在肿瘤患者尿液中有显著差异(P<0.05),人类乳头瘤病毒16型阳性率在肿瘤病理分级中有显著差异.人乳头瘤病毒16型在膀胱癌中分布为主.结论:高危人乳头瘤病毒可能与膀胱癌发生有关.     

HPV基因分型检测在宫颈疾病筛查中的意义

了解体检女性人乳头瘤病毒(HPV)感染型别分布及年龄特点,探讨HPV检测在宫颈癌及癌前病变筛查中的意义。采用凯普医用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术(Hybrimax),对1323例健康体检妇女进行宫颈21种HPV亚型感染筛查。1323例体检人群HPV总感染率为15.3%,21种亚型中有17种被检出,感染率最高的型别是HPV16,其他常见型别依次为52、58、68、53、45型,高危型感染率97.1%。1323例HPV感染率各年龄段检出率差异无统计学意义(P0.05)。甘肃地区健康体检女性人乳头瘤病毒(HPV)感染有相当比例,尤其是高危型,亚型分布且有一定区域性,对体检女性进行HPV分型检测有重要意义。     

人乳头瘤病毒16L1抗血清的制备和鉴定

人乳头瘤病毒16型是导致宫颈癌发生的主要因素,其晚期蛋白L1在体内或体外可自组装形成VLP颗粒.作者构建了DNA疫苗载体pDRVI1.0-16L1,大提质粒后免疫BalB/C小鼠制备抗体,并对抗体进行了特异性鉴定,为HPV16L1预防性疫苗的进一步研究和应用奠定了基础.     

女性HPV感染情况的调查与分析

目的 调查我院妇科门诊18 ～60岁女性宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染的情况,确定本地区的主要感染型别.方法 采用人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统对527例女性进行23种HPV基因型检测,分析宫颈病变中HPV亚型感染分布特点.结果 在被调查的527例女性中HPV感染总阳性率为43.8％（231/527）,单项感染占阳性感染的60％（139/231）,其中,低危感染占阳性感染的35％（81/231）,高危感染占阳性感染的25％（58/231）,高低危混合感染占阳性感染的40％（92/231）.主要感染型别为6、11、43、16、58和56,占单项及混合感染率为：6型占35.9％;11型占18.7％;43型占18.7％;16型占16.6％;58型占15.7％;56型占10.5％.结论 本地区HPV型别感染分布以6、11、43、16和58型感染为主.     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

58型HPV E6蛋白的原核表达与分离纯化

宫颈癌是一种在女性人群中的常见肿瘤,严重威胁着女性的生理和心理健康;而人类乳头瘤状病毒(HPV)的长期感染是宫颈癌发生的主要诱因.因此,HPV病毒的研究对于我们了解和防治宫颈癌有着十分积极的意义.目前,国外的研究比较多的针对于16型和18型的HPV病毒;但是对于我国比较常见的58型HPV病毒却研究甚少.所以,本试验依据实验室现有的表达纯化平台和噬菌体展示多肽筛选平台,设计并构建了HPV58 E6蛋白的原核表达体系,并对E6重组融合蛋白进行了诱导表达.通过对表达获得的包涵体蛋白进行反复的洗涤、亲和层析以及复性等纯化步骤,得到了纯度较高的E6融合蛋白.     

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体.方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A.HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上.结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础.     

人源IFITM2基因检测方法的建立及EMCV感染对IFITM2基因转录的影响

目的:建立一种干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,以期为IFITM2基因的动态监测提供有效的检测技术.方法:根据GenBank中公布的IFITM2基因序列设计特异性引物,以质粒pMD18-T-IFITM2为模板进行条件优化,绘制标准曲线,建立IFITM2基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行条件优化与评价,用建立的方法对脑心肌炎病毒感染后细胞中IFITM2基因转录水平进行检测.结果:建立的20μL检测体系中IFITM2基因最佳引物浓度为10μM,最佳退火温度为59℃;标准质粒在2.62×10~5～2.62×10~(10)copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好线性关系,线性方程y=-3.495 logx+43.12,R~2=0.998,且灵敏性、特异性和重复性均较高.应用建立的方法对EMCV感染细胞中IFITM2基因转录水平进行检测,结果显示,在感染早期IFITM2转录水平不变,感染后期转录水平逐渐升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基因转录水平的变化,可能与EMCV逃逸宿主相关免疫应答有关.结论:成功建立了一种快速、准确检测IFITM2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.该方法的建立,为进一步研究IFITM2在EMCV感染过程中的作用奠定了基础.     

子宫颈癌致病因子人乳头瘤病毒的发现——2008年度诺贝尔生理学或医学奖成果简介

瑞典卡罗林斯卡(Karolinska)学院诺贝尔奖评审委员会宣布德国科学家哈拉尔德·楚尔豪森(Harald zur Hausen)因发现人乳头瘤病毒(HPV)导致子宫颈癌,与另外两位法国科学家弗朗索瓦丝·巴尔-西诺西(Franoise Barré-Sinoussi)和吕克·蒙塔尼(Luc Montagnier)共享2008年度的诺贝尔生理学或医学奖。楚尔豪森以科学创新的精神和严格的科学实验向当时盛行的"单纯疱疹二型病毒(HSV-2)是子宫颈癌的致病因子"假说发起挑战,经过10多年的研究,于1983、1984年先后在人子宫颈癌活检标本中检测到HPV16、HPV18的基因序列,并成功克隆了HPV16型、HPV18型基因组,揭示HPV16、HPV18是子宫颈癌发病的重要病因。相继又鉴定了多种型别的HPV,提出了HPV家族具有"异质性"。发现HPV16、18的早期基因E6和E7整合于子宫颈癌宿主细胞的基因组内,提出E6和E7基因是诱发子宫颈癌的关键基因。这些重大发现极大推进了HPV研究领域的发展,也为今日HPV预防性疫苗的问世以及新HPV检测技术的不断发展奠定了科学基础。     

性传播性疾病尖锐湿疣与子宫颈癌的关系

尖锐湿疣(CA)是由人乳头瘤病毒HPV感染的性传播性疾病,而人乳头瘤病毒与人类肿瘤的发生有关,其中HPV—16、18等型与宫颈癌的关系尤为密切。全文简述了尖锐湿疣的组织学特征与HPV的关系,以及HPV感染可能是宫颈癌的致病因素。提示:尖锐湿疣与宫颈癌的发生有密切关系。     

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒感染基因型的检测

目的探讨吉林地区尖锐湿疣患者感染人乳头瘤病毒的基因类型和分布.方法收集临床病理学诊断为尖锐湿疣的疣体142例,采用DNA扩增技术检测疣体HPV基因类型.结果在142例标本中,127例(89.3%)基因型为HPV6/11和12例(8.5%)为HPV16/18.结论本地区尖锐湿疣患者感染低危型HPV6和HPV11型为主,少数为高危型HPV16和HPV18型.     

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因K-ras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBR GreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBR GreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.     

新疆维吾尔族宫颈鳞癌组织人乳头瘤病毒16型E6、E7基因变异分析

为探讨新疆维吾尔族宫颈鳞癌组织人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、E7基因序列的变异分布情况。采用43例维吾尔族妇女宫颈鳞癌组织中提取DNA作为模板,PCR扩增E6和E7全长基因,PCR产物直接测序。以欧洲标准株为原型,进行序列分析,并对HPV16 E6、E7进行进化树分析。结果显示,测序结果分析共发现6个突变位点(4个错义突变,2个无义突变),其中有34例E6基因350位核苷酸发生突变(T350G),突变频率为79.1%,对应氨基酸改变为Leucine→valine(L83V);6例E6基因295位核苷酸发生突变(T295G),突变频率为(14.0%),相应氨基酸改变为aspartic→glutamic(D64E),值得注意的是,这6例HPV16 E6基因T295G突变均伴随着E6基因T350G突变。E7基因仅在1例样本647位点发生常见的核苷酸A→G突变(A647G),且伴随着E6基因178位点T→G突变(T178G)。进化树分析表明,8例为HPV16欧洲型(Ep),34例为欧洲变异型(E),仅1例为亚洲型(As),没有发现非洲株(Af)和亚洲美洲株(AA)。由此可知:(1)新疆维吾尔族妇女主要以感染HPV16欧洲型(E)为主;(2)E6基因T295G-T350G共突变为特点的HPV16病毒,可能做为新疆维吾尔族妇女特有的HPV16欧洲型新疆株还需要进一步确认。     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

广东地区HPV16型L1基因的序列分析及其毕赤酵母表达载体的构建

目的: 分析广东地区人乳头瘤病毒(HPV)16型L1基因结构特点;构建广东分离株HPV16 L1毕赤酵母分泌型表达载体.方法:采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV16 L1基因,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαC,测序并对HPV16 L1基因进行序列分析.结果:成功扩增了广东地区HPV16 L1基因,并构建了其毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1.广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株相比有16处不同,同源性为98.99%,其编码的氨基酸序列有8处发生改变;与中国标准株比较有9处不同,同源性为99.18%,其编码的氨基酸序列有4处发生变化;发现在HPV16 L1基因序列中nt5 649、nt5 652、nt5 654、nt5 657、nt5 692、nt5 693,6个位点存在突变.结论:广东地区HPV16 L1基因序列与德国标准株、中国标准株相比较均存在差异;成功构建广东地区HPV16 L1真核表达载体.