红尾沙蜥超氧化物歧化酶适应高原的分子机制

结合基因组、转录物组、分子进化和蛋白质结构等分析探讨红尾沙蜥超氧化物歧化酶(SOD)活性升高的分子机制,结果表明,有鳞类基因组中包含SOD1、SOD2和SOD3 3类基因,其中SOD1基因具有较高的进化速率,且在组织中的表达水平占优势,是行使清除自由基功能的主导者.与低海拔荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥肝脏组织中SOD1基因及脑和心脏组织中SOD3基因表达水平显著升高,说明不同组织对氧化应激的适应策略不同.分子进化和蛋白质结构分析表明,红尾沙蜥SOD1基因受到强烈的正选择,其中43A-Q突变增强了蛋白质的亲水性,有利于蛋白质在细胞中积累到较高的浓度, 31S-N和106Q-R联合突变通过局部构象改变引起活性中心部位体积的增加,可能通过增加活性中心与底物接触的几率而提高催化效率.红尾沙蜥SOD活性升高的主要原因可能是SOD1和SOD3的表达上调及SOD1催化效率的提高.     

人EGF受体胞外域cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆编码人表皮生长因子受体(EGFR)胞外域的cDNA,构建可溶性EGFR(sEGFR)的哺乳动物细胞表达载体。方法：以RT—PCR方法从人胎盘中克隆编码EGFR胞外域的cDNA,测定其序列,构建sEGFR真核表达载体。结果：从人胎盘绒毛组织中成功克隆编码EGFR胞外域的cNDA,通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并添加终止密码,构建了sEGFR的真核表达载体。该基因编码的蛋白质包含信号肽以及L1、S1、12和S2等4个结构域。序列分析表明该基因有3个碱基与以往报道的基因不同,即1562G→A、1620G→C、1887T→A,前两个改变导致氨基酸Arg497Lys和Lys516Asn的改变,后一个为同义突变Thr605。结论：成功克隆编码EGFR胞外域的cDNA,并构建了sEGFR真核表达载体。     

结构域对小麦蛋白质二硫键异构酶性质的影响

小麦蛋白质二硫键异构酶(wPDI)由4个硫氧还蛋白结构域a-b-b'-a'和C-末端c尾组成.为考察wPDI各结构域对活性的影响,通过亚克隆表达了8个不同结构域组成的wPDI截短蛋白,表达产物经分离纯化后进行了酶学性质研究和蛋白质电泳分析.结果表明,所设计的8个wPDI截短蛋白在大肠杆菌BL21中得到了表达,金属螯合亲和层析和分子排阻层析后获得了纯度较高的wPDI截短蛋白;活性测定结果表明,wPDI的所有结构域对其二硫键氧化还原活性和分子伴侣活性都有贡献,c尾缺失不影响其异构活性,但提供了分子伴侣活性的关键氨基酸结合位点;对截短蛋白A和A'的电泳分析发现,wPDI的a结构域活性位点主要以氧化态为主,而a'结构域主要以还原态为主.研究结果为深入理解wPDI的功能性质奠定了基础.     

鞘氨醇单胞菌中威兰胶合成关键基因welE和welC的生物信息学分析

为探究威兰胶合成途径中关键基因welE和welC的结构特性及功能,运用生物信息学手段分析了welE和welC基因的序列信息,预测了其编码蛋白的理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化修饰、结构域及高级结构等.研究结果表明,WelE蛋白是由234个氨基酸组成的稳定亲水性蛋白质,无跨膜结构和信号肽,存在20个磷酸化位点,含有一个BY-kinase结构域,说明WelE可能参与威兰胶的生产与转运,WelE二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,三级结构呈"圆环状";WelC蛋白是由449个氨基酸组成的不稳定亲水性跨膜蛋白质,含有2个跨膜螺旋、无信号肽,存在39个磷酸化位点,含有一个Wzz结构域,这表明WelC可能与威兰胶链长调节有关,WelC二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构呈"条状",这些结果为解析welE和welC基因的功能以及建立威兰胶代谢调控方法奠定了理论基础.     

牦牛GPRIN3基因的克隆及组织表达分析

为探索GPRIN3基因的生物学特性,以麦洼牦牛为试验材料,利用RT-PCR技术扩增GPRIN3基因编码区序列并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测GPRIN3在牦牛不同组织的mRNA表达水平.结果表明,克隆得到GPRIN3基因编码区序列大小为2 343 bp,编码780个氨基酸残基;麦洼牦牛与野牦牛氨基酸序列相比,一致性为99.62%,共有3个位点发生突变,分别是103(G→R)、366(T→M)、404(E→K).系统进化分析显示,牦牛与野牦牛亲缘关系最近,其次是普通牛,与黑猩猩的亲缘关系最远;含有GRIN-C超家族保守功能结构域;实时荧光定量PCR结果表明,GPRIN3在麦洼牦牛肺脏组织中表达量最高,其次是肝脏,在臀肌中表达量最低.本研究为进一步探讨牦牛GPRIN3基因及其编码蛋白的结构和功能提供理论基础,为牦牛分子育种提供新思路.     

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.     

日本赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域分析

eRF1的C结构域与eRF3的C结构域相互作用对于蛋白质翻译终止过程中的快速反应至关重要.通过计算机同源建模对日本赭纤虫第一类肽链释放因子C结构域Bj-eRF1C进行结构模拟,发现在Bj-eRF1C结构域中有些肽段直接参与了eRF1-eRF3相互作用,特别是Bj-eRF1C结构域中V294和D297位点高度保守.通过定点突变与pull-down分析,表明在Bj-eRF1C结构域中V294和D297是eRF1-eRF3相互作用的关键位点.     

马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的生物信息学初步分析

本文根据马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的EST序列,运用多种生物信息学方法,对其进行初步的生物信息学分析.电子克隆获得了该基因的全长,结果表明:该序列全长1 742 bp,共编码357个氨基酸,有多个限制性酶切位点,有多个磷酸化位点,属于亲水性氨基酸,无信号肽,有膜穿透性.通过蛋白质二级结构功能域的预测,发现该序列中含有11个功能位点.通过蛋白质同源序列比对,发现该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因相似度极高,暗示该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因具有相似的生物学功能.以上结果可以为进一步研究该基因在马铃薯中特别是在抗青枯病分子育种中的功能提供相关依据.     

梅花鹿FGF10基因的生物信息学分析

应用生物信息学的方法对梅花鹿FGF10基因的核苷酸和氨基酸序列进行了初步的生物信息学分析,包括理化性质分析、信号肽和跨膜结构域分析、磷酸化位点和疏水性分析、蛋白质二级结构分析、功能结构域分析以及系统进化分析.结果表明:梅花鹿FGF10基因编码213个氨基酸,蛋白相对分子量为23.84kD,为碱性不稳定蛋白;存在信号肽和跨膜结构域;共有26个磷酸化位点;二级结构主要由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成.具有FGF典型的FGF结构域.系统进化分析显示,梅花鹿FGF10与哺乳动物FGF10相似性较高,并且与牛、羊在亲缘关系上最相近.为梅花鹿FGF10基因的结构和功能的进一步研究打下了坚实的理论基础.     

鳜鱼Siniperca chuatsi红肌sMyHC1基因cDNA的克隆及其表达分析

本研究采用同源克隆技术克隆鳜鱼红肌肌球蛋白重链1(sMyHC1)基因cDNA序列,其总长为5 940 bp。经生物信息学分析表明,鳜鱼sMyHC1基因cDNA编码区全长5 823 bp,总共编码1940个氨基酸。序列分析表明,鳜鱼MyHC1基因cDNA存在3个ATP结合位点、3个actin结合位点、1个ELC结合位点、1个RLC结合位点和2个Loop环。对鳜鱼sMyHC1基因进行成鱼红、白肌表达分析表明,其在红肌和心肌中的表达量显著高于白肌。研究结果为深入研究鳜鱼肌纤维分型及鳜鱼肉质研究提供可靠的实验数据和理论基础。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

马鹿mtDNA Cyt b基因的生物信息学分析

基于NCBI数据库获取马鹿（Cervus elaphus）Cyt b基因序列，应用生物信息学方法对马鹿Cyt b基因编码的蛋白质进行理化性质、结构和相关功能的预测分析，了解马鹿mtDNA Cyt b基因的结构、功能和表达特性.结果表明：马鹿Cyt b编码的蛋白质为疏水性蛋白质，推测相互作用的蛋白质包括LOC100524873,UQCRC1,UQCRQ,ND1,MT-ND2,COX1,COX2,COX3,ND4H和CYC，功能与电子运输、耦合质子运输以及泛醌-细胞色素c还原酶活性有关；二级结构主要为无规则卷曲，有2个潜在的N-糖基化位点和34个磷酸化位点，9个跨膜螺旋结构域，定位于内质网和细胞质膜；马鹿与梅花鹿（Cervus nippon）的亲缘关系较近.这对于马鹿种质鉴定分子标记的筛选及其与梅花鹿的渐渗杂交具有理论意义.     

大豆GmCBL7-2生物信息学及非生物胁迫表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白（CBL）作为植物钙离子信号感受器,在植物非生物胁迫和信号转导中发挥重要作用。对大豆Gm CBL7-2基因进行生物信息学分析及非生物胁迫下表达量的检测。Gm CBL7-2基因开放阅读框全长639 bp,编码一个含212个氨基酸的蛋白质,相对分子量24.4 kD,等电点4.56,属于亲水性蛋白。预测结果显示,Gm CBL7-2蛋白主要定位于细胞质中,含有13个磷酸化位点。Gm CBL7-2蛋白质3D结构模型中存在两个Ca2+结合位点。Gm CBL7-2蛋白与拟南芥At CBL7蛋白亲缘关系最近。表达量检测结果显示,Gm CBL7-2在大豆幼苗中可以响应干旱、高盐及低温胁迫,且对干旱胁迫的响应更加显著。     

梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆与表达

克隆得到梅花鹿过氧化氢酶基因序列,已提交Genbank登录(HQ877674).基因编码区全长1 584 bp,编码527个氨基酸,理论计算分子量为60 027.4 Da,理论计算等电点为6.67,预测蛋白质结构中不含有二硫键,在蛋白质序列中,具有过氧化氢酶家族活性中心保守序列和过氧化氢酶家族亚铁血红素保守序列,其DNA序列和蛋白质序列均与Bos taurus来源过氧化氢酶的同源关系最为接近.使用pPICZαC质粒和毕赤酵母GS115菌株,成功异源表达该基因,对诱导表达的发酵上清液进行活性测定,酶活为463 U·mL-1.     

中华鳖dct基因克隆及表达分析

为了阐明中华鳖酪氨酸酶家族成员dct基因的结构与表达特征,根据Ensembl数据库的中华鳖dct基因序列设计引物,运用RT-PCR技术进行开放阅读框(opening reading frame,ORF)克隆,并进行生物信息学分析,进而采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)技术检测正常体色和黄色中华鳖肺、肾脏、裙边和肌肉组织的mRNA表达水平.结果显示中华鳖dct基因ORF区全长1 578 bp,编码525个氨基酸,2种体色鳖dct基因序列完全一致;氨基酸序列分析得C末端无L-亮氨酸基序;N末端含有1个信号肽结构域;预测蛋白(成熟肽)分子质量为56.449 ku,理论等电点为6.67,不稳定指数为38.71,表明DCT蛋白是酸性稳定蛋白;预测DCT蛋白为亲水性蛋白;含有跨膜结构域、类表皮生长因子结构域、层粘连蛋白型类表皮生长因子结构域和2个铜离子结合结构域.系统发育树分析显示,在dct基因进化过程中,中华鳖与绿海龟和锦龟的亲缘关系较近.q-PCR结果表明:dct基因在同一个体各组织中均有表达,肺组织中相对表达量最高,且极显著高于其他3种组织;黄色中华鳖肺、肾脏和裙边组织dct 表达水平与正常体色鳖的相应组织均存在显著性差异.结果表明,中华鳖体色变异与dct基因突变无关,但dct基因表达改变可能对体色变异起了一定的作用.     

红螯光壳螯虾Hsp70基因的特征及其在热应激下的表达

从NCBI数据库中获得红螯光壳螯虾CqHsp70的cDNA全长2231 bp,可编码643个氨基酸,其中4—598aa为HSP70结构域.实时定量PCR结果表明,CqHsp70基因在红螯光壳螯虾的鳃、肝胰腺、血液中均有表达.在高温(34℃)应激过程中,红螯光壳螯虾CqHsp70基因在三个组织中的表达量呈先升高后降低的模...     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR分析不同发育时期意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因c DNA序列全长1 404 bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5 k Da,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR组织表达分析意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因cDNA序列全长1404bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5kDa,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。
     

不同物种间乙酰辅酶A羧化酶的差异性和相似性

采用生物信息学方法对GenBank, SwissProt中的拟南芥、大豆、甘蓝型油菜、小麦等物种的乙酰辅酶A羧化酶核苷酸和氨基酸序列进行了比对分析,进而对其组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、蛋白质二级结构、功能结构域、三级结构数进行了预测和分析.结果表明： ACC基因具有完整的开放阅读框,长约50683 bp,编码氨基酸相对分子质量为93.41 kD,理论等电点为7.27,是亲水性不稳定蛋白,二级结构均以α-螺旋和不规则卷曲为主要构件.通过进化树分析可分别将8种生物分为2组： A支包括小麦等7个物种,B支仅含甘蓝型油菜.     

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.