不同体外培养条件对牛体外受精胚胎质量影响的研究

研究探讨了不同体外培养条件下牛体外受精胚胎的发育速度及囊胚细胞数，从而了解不同体外培养系统对牛体外受精胚胎质量的影响，实验一中伴体外受精卵分别在ＳＯＦ＋牛输卵管上皮细胞（ＢＯＥＣ）和ＴＣＭ１９９＋ＢＯＥＣ两种培养系统内培养，在这两种培养条件下囊胚发育率分别为２２．２％和２１．２％，囊胚细胞数分别为１１３．３±５．０和９７．９±８．３，受精后第６～９ｄ的囊胚出现率分别为４０．１％，３７．０％，１９．     

牛胚胎体外生产技术的应用研究

利用屠宰牛卵巢抽出的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验，结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００－２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞标准密度培养，其卵裂率和囊胚发育率没有显著变化，体外授精时间可从成熟培养后２２小时延长至２７小时，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化。卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留孵丘细胞再培养４８小时形     

高产奶牛胚胎冷冻保存的研究

利用FSH＋PGF2，以非手术方法采得7—9日龄超排黑白花奶牛（20头）胚胎65枚。应用CL-5500冷冻仪，采用乙二醇作保护荆冷冻奶牛胚胎，其中42枚胚胎用于一步冷冻试验，水浴解冻后共回收39枚胚胎。     

牛体外受精胚胎在成份确定培养液内的发育

将牛体外受精胚胎培养于化学成份确定的 SOF+PVA的培养系统内 ,观察了不同PVA浓度对胚胎体外发育的影响 .结果在 1 mg/ml、3mg/ml和 5mg/ml的 PVA浓度条件下 ,囊胚的发育率分别为 2 7.5% a、1 9.1 % a和 4 .3% b( a>b,P<0 .0 1 ) .将体外受精胚胎分别培养于 M1 99+输卵管上皮细胞、SOF+BSA和 SOF+PVA的三种培养系统内 ,囊胚的发育率分别为 2 0 .4 %、2 9.0 %和 2 7.5% ,结果表明本研究确立的化学成份确定的体外培养系统可以用于牛体外受精胚胎的发育培养 .     

牛体外受精胚胎成份明确培养系统的建立

以 SOF为基本培养液 ,分别添加血清、PVA以及同时添加 PVA、肌醇和柠檬酸钠 ,进行牛体外受精卵的发育培养 ,三个处理组的囊胚发育率分别为 :3 2 .6%、1 1 .9%和 1 5 .9% ,血清处理组极显著高于两个 PVA处理组 (p<0 .0 1 ) .在此基础上 ,将受精处理后的卵子去掉卵丘细胞后 ,培养于 SOF PVA 肌醇 柠檬酸钠培养液内 ,以未去掉卵丘细胞的卵子为对照 ,两个处理组的囊胚发育率分别为 1 0 .8%和 2 1 .1 % .二者间没有显著差异 .结果表明没有血清和卵丘细胞的成份明确的培养系统能够支持牛体外受精卵发育至囊胚阶段 .     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与体外培养

研究了昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离、培养和生长特征,建立了快速、稳定的优质饲养层细胞培养体系.从不同日龄的胎鼠均分离到胚胎成纤维细胞,但最佳分离时间为13.5~14.5d;三种分离原代胚胎成纤维细胞的方法中胰酶消化法效果最好,能在较短的周期内获得大量原代及传代细胞;MEF细胞形态以小梭形为主,呈漩涡状、火焰状生长;增殖速度较快,每1~2d可传一代,按1∶3比例常规传代;5代以内适宜制作饲养层用,5代以后细胞开始变形呈现典型的衰老特征.     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻后孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的囊胚经冷冻—解冻后的孵化能力．在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为４７．７％．研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无显著差异（Ｐ＞０．０５）．     

体外培养绵羊卵母细胞核质成熟的研究

实验通过研究卵母细胞的核相及皮层颗粒的分布,探讨按照卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同绵羊卵母细胞在体外培养过程中的核质成熟情况,结果表明：（１）小卵泡卵经体外２４ｈ后的核质成熟率分别为４５．９％和２８．２％,远低于大（９３．５％,６６．７％）、中（８５．１％,５１．０％）两类卵泡卵,２）大卵泡卵在体外培养２０ｈ已完成核质成熟,较中等卵泡提前４ｈ。３）ｇｋｐｈｅ ３ｎｆｃ ｃ ｈ ｇｃｆｔ ｐｎ     

山羊胚胎的体外发育及冷冻保存研究

采用体外培养的方法，对山羊２～８细胞胚进行培养以后将体外发育至囊胚的胚胎进行冷冻保存，以便探讨山羊早期胚的体外培养方法和冷冻方法对体外发育胚冷冻效果的影响。将胚胎分别放入Ｍ１９９、Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞和Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞＋ＥＧＦ的培养液中进行培养，选取发育至囊胚期的胚胎分别以甘油和乙二醇为冷冻保护剂进行冷冻保存。结果体外培养胚的囊胚发育率在三个处理组中分别为１２．５％、７０．６％和７６．９％。使用Ｍ１９９处理组与添加输卵管上皮细胞、添加输卵管上皮细胞和ＥＧＦ的处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。冷冻解冻胚的形态正常率和发育率在以甘油和乙二醇为防冻剂的处理组中分别为６８．７、５８．３％和７８．６％、７２．８％。两组之间无明显差异，结果表明，采用与输卵管上皮细胞共同培养的方法能够提高山羊胚胎体外培养的发育率，以甘油和乙二醇为冷冻防冻剂均适合于山羊体外发育胚的冷冻保存，两者相比乙二醇的效果略优于甘油。     

小鼠未成熟卵母细胞体外培养

目的：探讨小鼠未成熟裸卵体外培养,获得较高的成熟率和受精率的适宜培养时间和培养条件。方法：在培养液中添加不同剂量的人绝经期促性腺激素（hMG)和卵泡刺激素（FSH）,分别培养从未行激素刺激排卵处理的昆明系小白卵巢中获得的未成熟裸卵,培养24h和48h后,进行体外受精和胚胎培养,结果：添加不同激素和培养不同时间对未成熟裸卵的体外成熟无显著性影响（P＞0．05）,但黄体生成素（LH）的存在对培养48h后成熟卵子的体外受精率有显著性影响（P＜0．05）,并随LH含量的增多,影响也越大。结论：未成熟裸卵能在体外培养成熟并受精,但培养液中LH含量对培养较长时间的成熟裸卵的体外精率有极显著的不利影响。     

胚胎的培养液平均拥有量和单独或群体培养对牛体外受精胚胎发育的影响

采用化学成分明确的培养系统,研究了胚胎的培养液平均拥有量以及单独或群体培养对牛IVF卵体外发育的影响.将牛体外受精(IVF)卵分别以每100、50和20μl培养液小滴内10枚卵子的形式进行发育培养,三个处理组的囊胚发育率分别为:6.0%、9.4%和14.3%,三者间无显著差异.在此基础上,选择培养效果较好的每枚胚胎2μl的培养液量,分别在20、10、4、2μl小滴内培养10、5、2、1枚胚胎,四个组的囊胚发育率分别为:10.0%、16.4%、10.0%、4.0%,5枚胚胎/10μl小滴处理组的囊胚率显著高于1枚胚胎/2μl处理组(p<0.05).研究结果表明:不同培养液拥有量以及单独或群体培养都可支持部分胚胎发育至囊胚阶段,降低培养液体积和群体培养更有助于牛IVF卵的体外发育.     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻的孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的襄胚经冷冻－解冻后的孵化能力,在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,襄胚经冷冻－解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,衰胚经冷冻－解冻后的孵化率为４７．７％,研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无明显差异     

应当重视人胚胎干细胞的研究

生物体个体发生的调控 ,也即单个受精卵细胞如何可以如此精确地分化为各种完全不同的细胞、组织和器官 ,并最终发育成为一个完整的生物体 ,一直是生命科学中的难解之谜 ,它被认为是与生命起源、意识产生（即中枢神经系统的信息加工）并列的生命科学的３大难题之一。很显然 ,这３大问题是生物学中“上帝”存在论的最后防线 ,因而对它们的研究 ,在自然科学中具有特殊的重要意义。发育生物学的研究表明 ,受精卵在分裂期的早期 ,尚未植入子宫之前形成一个称为囊胚（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）的结构 ,它由大约１４０个左右的细胞组成。囊胚的“外壳…     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

兔胚胎在不同培养液中体外发育的比较

本试验对比兔2细胞胚胎在三种培养液中体外培养144h后的发育状况。三种培养液分别为：加小牛血清的A组M199培养液、加牛白蛋白5片段的B组M199培养液和加胰岛素、转铁蛋白及谷氨酰胺的C组M199培养液。从发育速度看,A组和B组比C组的胚胎发育快;从发育效果看,发育到囊胚和孵化囊胚的比例,A、B、C三组分别为77．0％、64．8％及7．0％。这两方面结果都说明A、B组培养效果接近,C组的培养效果较差。试验结果表明,B组培养液是研究影响兔胚胎发育因素的适宜培养液。     

胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养

目的:探讨胚胎大鼠肺成纤维细胞的体外培养条件.方法:采用胶原酶消化19d胎鼠肺组织块,经差速离心和反复贴壁法,分离、纯化肺成纤维细胞后采用加胎牛血清的DMEM培养液,进行细胞培养.用波形蛋白免疫细胞化学染色对所分离的细胞进行鉴定.结果:细胞培养24h后有一定量细胞贴壁,48h后贴壁细胞开始生长.结论:该实验方法可以成功地培养大鼠胚胎肺成纤维细胞.     

小鼠早期胚胎体外培养技术中几种化学因素的影响

与胚胎体外培养有关的一些化学物质，如液体石蜡、ＣＯ２、乙醇和水质等，对小鼠早期胚胎发育有明显的影响．有的液体石蜡对胚胎有毒害作用，这种毒害作用与其比重和所含的硝基萘杂质无关．有的国产液体石蜡适合于做早期胚胎培养之用．培养液中混入乙醇对胚胎发育危害很大，浓度达到０．８％时，胚胎完全不发育，而浓度低于０．０５％时，则无明显影响．酒精厂生产的ＣＯ２粗制品，乙醇含量约为～０．１８％，完全适合于做胚胎培养的ＣＯ２气源．用三蒸水配制的培养液进行胚胎体外培养，可获得良好效果．     

胚胎干细胞的体外扩增

探讨了胚胎干细胞在体外大量扩增的方法。将胚胎干细胞复苏后，选择合适的培养基(含高糖和谷氨酰胺的DMEM，加入ψ=20％胎牛血清，10^5U/L青链霉素双抗，0．1mmol／L L—谷氨酰胺，10^3IU／L白血病抑制因子，0．1mmol／L β-巯基乙醇)进行培养。此外，使用早代胚胎于细胞；培养时使用不涂明胶的一次性培养瓶；掌握好消化、复苏和冻存时机并及时换液；按照严格步骤进行培养、传代、冻仔。对扩增后的ES细胞进行染色体和全能性检测。结果表明，在较短时问内(5d)可将胚胎干细胞扩增16倍以上。扩增后的ES细胞较好地保持了胚胎干细胞的全能性和核型。可见使用合适的培养基，按照严格步骤操作，短期内完全可以大量扩增胚胎干细胞。