β-防御素的生物学活性及应用前景

β-防御素是近年来发现的一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽,在天然性免疫和获得性免疫中发挥着重要的作用.本文对β-防御素生物学活性及应用研究进展进行了综述.     

β-防御素的合成及构效关系

防御素是抗菌肽中的一大家族,从植物到动物均有表达.β-防御素含多个二硫键,在先天免疫系统中具有重要作用,除抗菌活性外,还具有其他重要的生物学功能,如抗病毒作用,与受体、趋化因子相互作用等.综述了β-防御素在合成、结构特征和构效关系方面的最新研究进展.     

鸡β-防御素及其基因工程研究进展

鸡β-防御素作为鸡重要的天然免疫屏障,对于细菌、真菌乃至某些被膜病毒有广谱高效杀伤作用.该文着重描述了鸡β-防御素的分子结构、抗菌机理、生物活性及其基因工程研究进展,并从原核系统和真核系统的基因克隆与表达的研究现状进行了综述.     

植物防御素研究进展

植物防御素是植物自身合成的能够抵抗环境中微生物侵害的一类小分子肽.本文对植物防御素的结构特征、类型、生物学作用、抗菌机理与模型进行了综述,并简述了其研究意义和应用前景.     

哺乳动物防御素的研究及应用

防御素(Defensins)是近年来发现的广泛存在于生物界的一类阳离子抗菌活性肽.其中哺乳动物防御素的抗菌谱最为广泛,具有很高的应用潜力.文章针对哺乳动物防御素的组成分布、表达调控、生物学活性、基因工程等方面进行了研究.     

人防御素HNP4在毕赤酵母中的表达

为了构建人防御素HNP4重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K-HNP4,建立高效、稳定表达人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株,并对表达产物进行检测与分析.利用PCR技术从pUC18-HNP4上扩增人防御素HNP4,构建人防御素HNP4重组表达载体pPIC9K-HNP4.SacI线性化后电击法转化入毕赤酵母GS115中,再通过同源重组到酵母染色体上,用G418筛选高表达菌株,在三角摇瓶中0.5%甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,用标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株混菌板鉴定活性.结果显示,SDS-PAGE和Western-blotting可检测到大小4.0 kDa左右的目的蛋白条带,表达量可达到500 mg/L,表达的重组人防御素HNP4具有较强的杀菌或抑菌活性.提示成功构建人防御素HNP4重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-HNP4,并建立高效、稳定表达有明显抗菌活性的重组人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株.     

脊椎动物β-防御素的研究进展

防御素是近年来发现的广泛存在于动植物体内的一类富含精氨酸和半胱氨酸残基的阳离子抗菌肽。脊椎动物的防御素分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3种,其中β-防御素分布区域最为广泛,在脊椎动物的呼吸道、消化道及泌尿生殖道粘膜层有大量表达。其在机体受到感染的早期抑制、抵御和杀灭多种外来病原微生物等方面发挥着不可取代的作用。综述了国内外β-防御素的研究现状,从其蛋白质分子结构、基因的结构及表达调控、抗微生物活性及作用机制、与炎症反应的关系以及作为效应分子和调节分子等角度入手,探讨了脊椎动物β-防御素在免疫应答中的重要作用,并提出了它的应用前景和存在的问题。     

人β防御素3基因在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达

根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性和β防御素3全基因中G．C、A、T含量的平衡,设计搭桥引物,通过PCR法合成人β防御素全基因序列,克隆到真核表达载体pPICZα-A,测序确认．将重组体电击转化酵母GS115,转化子经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性．结果表明,目的基因在毕赤酵母中已得到表达,表达量为0．22mg／mL,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抑菌活性．     

胡椒碱对脂多糖和金黄色葡萄球菌抑制人结肠腺癌细胞系表达防御素的拮抗作用

目的:研究胡椒碱(piperine,PIP)对脂多糖(LPS)和灭活金黄色葡萄球菌(SAC)菌体抑制人结肠腺癌HT-29和Caco-2细胞表达防御素(Defensin)的影响.方法:WST-1法检测PIP对HT-29和Caco-2细胞增殖的作用;定量PCR(qRT-PCR)检测人α防御素DEFA5(HD5)和DEFA6(HD6),人β防御素HBD-1以及胰岛再生源蛋白(Reg)Reg IIIγ等mRNA的表达水平.结果:PIP处理可剂量依赖性地抑制HT-29和Caco-2细胞的增殖,半数抑制浓度IC50分别为328.5μmol/L和155.1μmol/L,表明PIP对细胞的毒性较小;定量PCR检测显示,PIP处理对LPS或SAC下调HT-29和Caco-2细胞DEFA5和DEFA6 mRNA表达水平具有显著的拮抗作用,对DEFB1和Reg IIIγmRNA的表达没有明显影响.结论:胡椒碱可能通过拮抗病原体诱导细胞表达防御素的抑制作用,进而发挥其抗肠炎作用.     

植物防御素研究进展

植物防御素是一类分子量小、呈碱性、富含半胱氨酸的短肽.通常在很低的浓度下(10-6mol.L-1)就能表现出广谱抗菌活性,它是植物防御体系的基本组成成分之一,可以用来研制新型的杀菌剂,在植物抗病基因工程等方面发挥着重要作用.对其结构特征、类型、生物合成、表达调控、抗菌机理及其基因工程等方面的研究进行了汇总,对其应用前景进行了展望.     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1)cDNA的扩增与组织表达

为了获得蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1)的cDNA序列,从蒙古绵羊瘤胃的上皮组织中提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增蒙古绵羊SBD-1的部分cDNA,结果扩增出cDNA 300个碱基.该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸的前原防御素.为了检测SBD-1mRNA在蒙古绵羊体内可能的表达器官,通过RT-PCR方法研究了SBD-1基因在蒙古绵羊各组织中的表达分布,结果显示,该基因在整个消化道(除直肠外)、气管、子宫、脾脏等管状器官内的黏膜层和脾脏内均有表达,而在所检测的实质性器官内,如心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、卵巢等中没有表达.     

葱蝇防御素基因的鉴定及针刺对基因表达的影响

【目的】分析葱蝇(Deliaantiqua)防御素基因家族的序列特征、分子进化和基因表达模式,了解防御素基因在滞育期的免疫应答特征。【方法】利用生物信息学方法,从转录组数据库中搜索防御素基因家族的序列,并进行基因鉴定、系统发育、选择压力及针刺刺激对基因表达的影响分析。【结果】共鉴定出3个防御素前体序列及由此形成的40个氨基酸残基组成的成熟肽Da Df1e ,Da Df2e 和 Da Df3e ,理论分子量分别为4.09,4.124.09k Da;等电点分别为8.71,8.69和8.35;它们具有昆虫防御素的典型的保守结构域,有3对分子内二硫键,均为外分泌型、稳定多肽。系统发育分析显示葱蝇防御素成熟肽Dadef1与新陆原伏蝇(Protophormiaterraenovae)、丝光绿蝇(Luciliasericata)和家蝇(Muscadomestica)防御素亲缘关系最近并聚为一枝,再与 Dadef2和 Dadef3聚为一枝。基因表达分析表明针刺能明显影响葱蝇防御素基因的表达。【结论】葱蝇防御素基因家族序列保守性高,具有典型的家族特征;它们的表达模式在冬滞育和非滞育蛹的不同发育时期存在明显差异,说明葱蝇冬滞育蛹和非滞育蛹的免疫应答存在差异。研究结果为进一步研究昆虫防御素类抗菌肽的结构特征、进化以及滞育条件下免疫活动提供理论基础。
     

白菜防御素基因的预测及结构功能分析

采用生物信息学的方法,通过已知防御素基因家族基因氨基酸序列在线Blast相似性比对,对白菜(Brassicarapa)基因组中防御素基因进行了预测和鉴定,分析了防御素基因在进化过程中各部分结构,包括上游区域、启动子区域、外显子区域、内含子区域以及UTR区域的结构变异以及功能变异,对该基因上游序列顺式作用元件和表达模式进行了预测。分析结果表明,白菜防御素基因编码60～80个氨基酸短肽,编码氨基酸均具有8个保守的半胱氨酸;白菜防御素基因功能结构域保持相对稳定,但部分基因成员前端信号肽序列出现变异;内含子长度出现增长、缩短、消失等3种变异模式;该基因上游启动子区域核苷酸变异较其他区域显著,上游序列顺式作用元件大多与光应答、逆境胁迫应答和信号分子应答相关。该基因表达模式预测结果表明白菜防御素基因在进化过程中可能出现分化,主要体现在基因沉默和表达部位的差异。     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

紫藤种子总RNA提取方法研究

分离提取高质量的RNA是基因表达、调控和基因工程等研究的基础。植物组织中含有大量RNA酶、多糖和酚类等杂质,影响了高质量总RNA的获得。应用改良的CTAB法提取紫藤种子中的总RNA,添加了PVP、β-巯基乙醇和水饱和酚氯仿后能有效地除去大部分杂质,获得高质量的紫藤种子总RNA。3'RACE实验结果表明,以此总RNA反转录获得的cDNA为模板,可成功扩增紫藤种子中的防御素基因。     

半月国内科技要闻

世界首例转人防御素基因克隆奶牛诞生（图） 由中国动物胚胎工程专家、西北农林科技大学张涌教授历时十年主持培育的世界首例转人防御素基因克隆奶牛在陕西杨凌科元奶牛场通过剖腹产降生。这头克隆奶牛出生体重达40.1公斤,体质健壮,毛色光亮。     

诸葛菜植物防御素基因克隆与原核表达研究

以从正在萌发的诸葛菜种子中提取总RNA反转录成的cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得了160 bp的植物防御素cDNA片段.然后将该片段克隆到pMD18-T载体. 经测序后将片段酶切回收,再克隆到GTK原核表达载体中. 经0.1 mmol/L IPTG诱导表达,获得了与理论值相符的32 kD的融合蛋白质条带. 用GST单克隆抗体做第一抗体进行WesternBlot检测,获得阳性结果. 这为诸葛菜植物防御素基因功能的研究提供了基础.     

人工合成绿蝇防御素及其活性研究

采用人工合成的方法研究绿蝇防御索（phormicin A）对细胞及肿瘤作用效果，实验结果发现，人工合成的绿蝇防御素可以在较低浓度下抑制革兰氏阳性菌的生长（MIC＝5－75μg/mL），其中以金黄色葡萄球菌的反应最为敏感，MIC为5μg/mL，而且当人工合成的绿蝇防御素浓度升至300μg/mL时可以抑制大肠杆菌的生长，但无法抑制绿脓杆菌的生长，此外，它还能抑制MDA435乳腺癌细胞及TSU前列腺癌细胞的体外增殖，抑制率分别为22．21％（P＜0．05）和35．53％（P＜0．01）。     

人β-防御素-2植物表达载体的构建

用重组基因 (hBD 2 )替换双元载体 pCAMBIA130 4中的GUS GFP基因 ,构建成植物表达载体pCAMBIA130 4 hBD2 ,并经过了酶切、PCR和序列分析验证 .该载体的构建可为培育转基因抗病植物和利用生物反应器生产防御素奠定基础 .