口腔碘泡虫宿主新纪录及种群分化研究

【目的】研究口腔碘泡虫(Myxobolus oralis)宿主新记录及种群分化。【方法】基于形态特征、18Sr DNA序列相似度、遗传距离、变异位点、系统发育以及18Sr RNA序列V4区二级结构的预测,对口腔碘泡虫江西种群和湖北种群进行了比较分析。【结果】口腔碘泡虫江西种群与湖北种群形态学特征基本一致;两种群18Sr DNA序列相似度为99%,变异位点数为6个,遗传距离为0.003,18Sr RNA序列V4区二级结构无差异;口腔碘泡虫湖北种群先于江西种群分化出来。【结论】口腔碘泡虫与宿主可能并未经历协同进化的自然历史 过 程;口 腔 碘 泡 虫 可 能 先 寄 生 于 异 育 银 鲫(Carassius auratus gibelio),然后少数个体偶然发生宿主转移事件而进入鲫(Carassius auratus auratus)体内并在长期的进化中逐渐适应这种新的寄生关系,最终形成新的种群或亚种。
     

葱蝇PDK1基因的克隆及生物信息学分析

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase1,PDK1)是磷脂酰肌醇3-激酶(Phos-phatidylinositol-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)信号通路中一个关键的激酶。该通路在人(Homo sapiens)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中是一条保守的通路,通过激活下游的因子对代谢、细胞分化、寿命等产生重要调节作用。本研究基于葱蝇(Delia antiqua)转录组数据通过生物信息学分析从其中鉴定出PDK1基因4条Unigene序列,并通过PCR技术克隆了PDK1基因的全长cDNA,命名为DaPDK1,其全长为3215bp,开放阅读框长2730bp,编码909个氨基酸。采用生物信息学的方法,推测该基因编码的蛋白质相对分子质量为100.3kD,等电点为8.53。该蛋白第87~109氨基酸是跨膜区,第284~627和744~833氨基酸是两个保守结构域STKc和PH。同源性分析表明DaPDK1蛋白与地中海实蝇(Ceratitis capitata)PDK1蛋白氨基酸序列相似性最高(一致率为53.1%,相似率为63.2%)。本研究结果有望为进一步研究葱蝇PI3K/Akt信号通路中PDK1基因的特性及功能奠定基础。
     

中华按蚊AsAce1基因的鉴定及生物信息学分析

利用同源性搜索,在中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中鉴定出1条乙酰胆碱酯酶(Ace)家族序列,命名为AsAce1(GenBank登录号:KU900233)。该基因序列的全长为5592bp,编码区序列长度为2253bp,编码750个氨基酸。在理化性质、二级结构、三级结构、系统发生、基因结构等方面对该基因及所编码蛋白进行了预测和分析。结果表明AsAce1蛋白在按蚊中具有很高的保守性;该蛋白是亲水性蛋白,分子量、等电点分别为82.41kD,5.92,二级结构主要以不规则卷曲为主,无跨膜结构域和信号肽;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中;基因结构为两种相位(1位和2位内含子)。研究结果为AsAce1基因生物学功能的挖掘奠定了理论基础。
     

瓶囊碘泡虫HSP70基因的克隆、鉴定及功能预测

HSP70(Heat shock proteins 70)是分子量约为70kD的热休克蛋白,具有保护细胞和生命体的重要作用。通过分子克隆和染色体步移技术首次获得瓶囊碘泡虫(Myxobolus ampullicapsulatus Zhao et al.,2008)HSP70家族同源基因的完整序列,并利用生物信息学方法对该基因进行鉴定,同时对它编码的蛋白序列进行分析。结果显示:瓶囊碘泡虫HSP70蛋白为HSPA8同源物,命名为MaHSPA8;MaHSPA8基因核苷酸序列全长2 696bp,共编码662个氨基酸,MaHSPA8蛋白相对分子量为72.5kD,等电点为5.37,无跨膜区和信号肽,共有24个潜在的抗原位点。此发现将为进一步研究HSP70基因在瓶囊碘泡虫寄生过程中的作用提供基础资料。     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4008bp,编码区序列长度为1941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(A-nophelesstephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C3222H4925N875O947S32,为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
     

贵州草海鲫鱼Spo11基因的克隆、生物信息学和表达分析

【目的】探索环境内分泌干扰物壬基酚(Nonylphenol,NP)对贵州草海鲫鱼(Carassius auratus)Spo11 基因表达的影响。【方法】通过PCR方法克隆实验鱼Spo11 基因,利用生物信息学方法分析SPO11蛋白的氨基酸序列、理化性质和结构特点;并设置1个对照组和低、中、高共3个不同剂量NP处理组,用NP质量浓度分别为0,25,50和100μg·L-1的水体浸浴实验鱼28d后,检测各组实验鱼Spo11 基因的表达情况。【结果】Spo11 基因c DNA序列长度为1471bp(Gen-Bank登录号:MF66470),包括66bp的5′非翻译区、编码383个氨基酸的1152bp的开放阅读框和253bp的3′非翻译区。预测SPO11蛋白质相对分子质量为43.23k Da,等电点IP为6.89,主要由亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸组成。该蛋白是含有信号肽的不稳性亲水蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。与对照组实验鱼的Spo11 基因相对表达量相比,中剂量和高剂量的NP处理组实验鱼Spo11 基因相对表达量均有所升高,与前者的差异均具有统计学意义(p<0.05)。【结论】环境内分泌干扰物NP可以影响贵州草海鲫鱼Spo11 基因的表达。
     

葱蝇己糖激酶基因的鉴定、特征分析及在滞育期的表达分析

基于转录组数据,首次鉴定了葱蝇(Delia antiqua)2条己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因分别命名为Da HXK-1和Da HXK-2。Da HXK-1基因含有1 544 bp的开放阅读框,编码513个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为58.3k D和5.97;Da HXK-2基因的开放阅读框为2 512 bp,编码819个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为91.1 k D和9.19,二者编码的蛋白同为胞质型蛋白,具有该酶蛋白质典型的保守结构域,且与家蝇(Musca domestica)Md HXK-1和Md HXK-2蛋白的同源性分别为74%和78%;系统发育分析显示它们与其他双翅目(Diptera)昆虫的己糖激酶的进化关系最近,表明己糖激酶在进化过程中比较保守。基因表达分析显示Da HXK-1和Da HXK-2基因在夏滞育蛹中都下调表达;Da HXK-1基因在冬滞育蛹中的表达呈先上升后下降趋势,Da HXK-2基因的表达模式则相反。研究认为Da HXK-1和Da HXK-2基因的不同表达模式可能与组织特异性有关。
     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR组织表达分析意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因cDNA序列全长1404bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5kDa,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。
     

昆虫致病性斯氏线虫亲环素基因的克隆、特征及表达分析

亲环蛋白(Cyclophilin)广泛存在于原核和真核生物中,在进化过程中结构保守,多数具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性。本文在斯氏线虫(Steinernema car poca psae)差减杂交分析的基础上,克隆一个亲环蛋白基因(Sca-CYN)。该胞质蛋白有171个氨基酸组成,分子量约为16.2kD,等电点约为6.89。BLAST分析表明,Sca-CYN蛋白与线虫、昆虫及其它生物亲环蛋白的序列一致性达75%~89%。基因表达分析显示该基因在寄生初期就上调表达。序列比较及进化标记分析发现Sca-CYN为秀丽隐杆线虫亲环蛋白3的直系同源蛋白。同源建模分析显示该蛋白具有亲环蛋白的经典三维结构。系统发育分析结果表明该蛋白在进化早期与其同源基因分离。研究结果为进一步研究该基因功能及探讨线虫亲环蛋白基因家族的分子进化提供基础。
     

铜锈环棱螺HSP70对Cd和BDE-47胁迫的响应敏感性

采用沉积物生物毒性测试,分别研究了不同含量Cd和BDE-47污染沉积物对铜锈环棱螺(Bellam ya aeruginosa)肝胰脏热休克蛋白HSP70表达水平的变化,以揭示Cd和BDE-47胁迫与HSP70表达响应的时间/剂量-效应关系,探讨HSP70作为持久性有毒物质对铜锈环棱螺早期伤害生物标志物的敏感性。结果表明,受到不同含量Cd和BDE-47加标沉积物胁迫后,铜锈环棱螺肝胰脏HSP70表达均表现出较为明显的时间/剂量-效应关系。在Cd短期(0~10d)暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高而显著升高(p<0.05);在Cd长期(10~21d)暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高表现为先升后降,低Cd含量(5μg·g-1)暴露下HSP70应激水平随暴露时间的延长而显著上升(p<0.05);中、高Cd含量(25、100μg·g-1)暴露下HSP70应激水平随时间的延长均呈先升后降的趋势。不同含量BDE-47暴露下HSP70应激水平时间的延长大体上均呈先升高后降低的变化趋势;低、中含量BDE-47(160、640ng·g-1)短期暴露对HSP70应激水平没有影响,而长期(10~21d)暴露后,HSP70应激水平均显著降低(p<0.05)。比较而言,HSP70对Cd低含量(5μg·g-1)短期(低于10d)暴露显示出较好的敏感性,而对BDE-47低含量(160ng·g-1)短期暴露表现不敏感;低含量Cd和BDE-47长时间(10~21d)暴露下,HSP70均具有较好的指示作用。
     

黑腹果蝇热激蛋白基因家族的生物信息学分析

热激蛋白是细胞或生物体受到热激后新合成的一类遗传上高度保守的蛋白,在生物体中普遍存在,在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用.本研究利用生物信息学方法首次对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)全部热激蛋白进行分析.结果表明,黑腹果蝇热激蛋白共有HSPC(HSP90)、HSPA(H...     

鲫葡萄糖调节蛋白78基因部分序列的克隆、鉴定及功能预测

【目的】分析和预测鲫(Carassius auratus)葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)的功能,为研究GRP78在鱼类受细胞外刺激过程中的作用机制奠定基础。【方法】通过分子克隆技术获得鲫GRP78基因的部分序列,并利用生物信息学方法分析了该基因片段编码的蛋白质序列的二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性和抗原表位。【结果】获得了长度为617bp的鲫GRP78基因片段序列,共编码113个氨基酸。这些氨基酸所构成序列的相对分子质量约为1.3kDa,等电点为5.82,无信号肽;可塑性区域位于第7～10位、第18～21位、第28～42位、第51～62位、第68～78位和第94～109位氨基酸残基;表面可及性区域位于第29～30位、第38～43位、第50～65位、第68～79位、第82～86位、第97～99位、第102～104位和第106～111位氨基酸残基;有1个B细胞抗原表位区域,位于第28～45位氨基酸残基。【结论】所获的鲫GRP78序列中含有ATPase保守结构域区段,该区段定位于内质网,具有较强亲水性。     

大丽轮枝菌VDmef2基因抗逆及致病相关性分析

【目的】分析转录因子VDmef2在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中的功能。【方法】通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因重组法获得了VDmef2基因的定点敲除突变体,然后分析了该突变体在不同碳源及逆境条件下的表型以及大丽轮枝菌在MIM培养基上微菌核的形成情况,还分析了大丽轮枝菌对陆地棉(Gossypium hirsutum)的致病力。【结果】大丽轮枝菌转录因子VDmef2定位于细胞核。VDmef2 基因突变后,大丽轮枝菌微菌核形成能力降低,同时对H2O2更加敏感,也丧失了对陆地棉的致病力。【结论】转录因子VDmef2与大丽轮枝菌微菌核形成、耐氧化及致病力有关。
     

荆州碘泡虫寄生部位种群分化

【目的】研究荆 州 碘 泡 虫(Myxobolus kingchowensis)寄 生 于 同 种 宿 主 不 同 寄 生 部 位 的 种 群 分 化 及 系 统 发 育 关 系。【方法】对荆州碘泡虫不同种群及相似物种的形态和它们18Sr DNA 序列的变异位点、相似度、遗传距离、AT 碱基比进行比较,分析了它们的系统发育关系。【结果】荆州碘泡虫重庆胆囊种群、武汉肌肉种群和武汉肾脏种群的形态学特征基本一致。各种群18Sr DNA 序列相似度为98.8%~100.0%,遗传距离为0.000~0.009,变异位点数为3~12个,AT 碱基比(53.29%)高于 GC碱基比(46.71%)。荆州碘泡虫不同种群及相似物种的系统发育树分为两大枝,孢子前端平滑且钝圆的的物种聚为一枝,孢子前端较尖的物种聚为了另一枝;鳃寄生的碘泡虫整体处于该系统发育树的基部。【结论】寄生于异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)上不同器官部位的荆州碘泡虫已出现种群分化;孢子形态上相似的碘泡虫物种具有更近的亲缘关系;较之于肌肉、肾脏、胆囊、骨骼肌、鳔和肠寄生的碘泡虫而言,鳃寄生碘泡虫分化较早。
     

蜡梅热激蛋白基因 Cp HSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析

在已构建的蜡梅花转录组数据库EST序列分析的基础上,采用 RACE技术克隆获得蜡梅热激蛋白 HSP70的cDNA序列,命名为CpHSP70‐1（GenBank登录号：KR071130）．该序列全长2520 bp ,包括1962 bp的完整开放阅读框,编码653个氨基酸蛋白序列,含有3个 HSP70家族典型基序．CpHS P70‐1蛋白与其他真核生物的HSP70蛋白具有较高的同源性,聚类分析显示其属于定位于细胞核／细胞质的蛋白．亚细胞定位结果支持该蛋白分布于细胞核的预测．利用实时荧光定量PCR对 CpHS P70‐1基因的表达特性进行分析,其在各组织中均有不同程度的表达,其中在成熟叶片中表达量最高;在不同花发育阶段呈现持续稳定的表达模式;该基因在低温和高温诱导下表达量提高,而且对高温的响应更为敏感．     

哺乳动物Gpx 基因家族进化选择和功能分歧研究 (动物科学)

研究哺乳动物谷胱甘肽过氧化物酶基因家族(Gpx)的亲缘关系和进化选择压力性质。从NCBI等网站获取哺乳动物Gpx基因编码区核酸序列和GPX蛋白氨基酸序列,并用MEGA、Clustal构建亲缘关系树,用SignalP和TargetP分析信号肽和亚细胞定位信息;用K estimator和PAML分析其Gpx基因家族进化先后顺序和选择压力;用Diverge分析GPX蛋白家族功能分歧。结果表明,GPX蛋白家族进化中形成两个亚类,其一包括GPX1和GPX2,其二包括GPX3、GPX5和GPX6;各GPX蛋白成员均有高度保守的GPX蛋白家族基序和高度保守的硒代半胱氨酸或半胱氨酸残基,氨基端信号肽分析显示,GPX1蛋白为胞浆线粒体型,其余家族成员均为胞外分泌型;哺乳动物Gpx1基因进化上受到严格的负选择作用,Gpx基因家族成员保守区也受到负选择作用,但用枝位点模型却检出了正选择作用,GPX蛋白家族内存在轻微的功能分歧。哺乳动物GPX蛋白家族的进化上的负选择作用表明其在哺乳动物清除自由基抗氧化方面的关键作用。     

大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

柞蚕微孢子虫长极丝型孢子总蛋白的鉴定及功能分析

柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville)是中国北方重要的吐丝经济昆虫,柞蚕微孢子虫(Nosema antheraeae)引起的柞蚕微粒子病是柞蚕产业毁灭性的病害。本研究采用梯度Percoll-NaCl溶液分离纯化柞蚕微孢子虫,提取柞蚕微孢子虫总蛋白,胰蛋白酶消化,然后通过LC-MS/MS精确获得各肽段分子量,经数据库比对后共鉴定到610个蛋白。对鉴定到的蛋白质进行GO蛋白质功能分析,发现孢子时期参与大分子复合物及结构分子活性的蛋白的较多,而参与细胞催化和绑定功能、细胞过程及代谢过程的表达蛋白的所占的比例明显低于预测基因的的比例。研究认为这一结果主要与孢子期的微孢子虫脱离宿主细胞,生理不活跃,处于相对静止的时期,没有能量和物质来源有关;微孢子虫通过降低细胞活动和物质代谢,从而适应所处的环境。
     

四纹豆象小分子量热激蛋白基因的鉴定与表达分析

本研究利用生物信息学方法对NCBI数据库中四纹豆象(Callosobruchus maculatus)全部热激蛋白进行分析,从中鉴定出一种中央区具有典型α-晶体蛋白质结构域的小分子量热激蛋白基因,shsp27(Gen Bank编号FK669241.1)。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测了四纹豆象4龄幼虫经不同温度(4、15、30、37℃以及4℃低温处理24 h后回复30℃)胁迫处理24 h后,shsp27 m RNA的相对表达量。分析结果表明,在4龄四纹豆象幼虫中,低温(4、15℃)与高温(37℃)胁迫处理后shsp27的相对表达量相对于对照组(30℃恒温培养组)均有上调响应,但对高温胁迫的响应程度略强,低温回复处理组的相对表达量也略高于对照组,但上升不显著,初步认为shsp27基因表达与四纹豆象耐寒热的适应性无直接相关性。