东方蜜蜂微孢子虫环介导恒温扩增检测方法的建立

以从重庆酉阳分离到的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)为研究对象,以该物种16SrDNA作为靶标,设计引物并采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测东方蜜蜂微孢子虫。实验结果显示,LAMP检测的最佳条件为内引物浓度5μmol·L~(-1),聚合酶用量800U;以研究对象16SrDNA质粒为模板,LAMP检测的最低质量浓度为1.735×10~(-2)ng·μL~(-1),PCR检测的最低质量浓度为1.735×10~(-1)ng·μL~(-1);以研究对象基因组DNA为模板,LAMP检测的最低质量浓度为1.475×10~(-3)ng·μL~(-1),PCR检测的最低质量浓度为1.475×10~(-1)ng·μL~(-1);以研究对象基因组DNA、正常中蜂(Apis cerana)中肠基因组DNA、正常意蜂(Apis mellifera ligustica)中肠基因组DNA、正常家蚕(Bombyx mori)中肠基因组DNA、蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)孢子基因组DNA和中蜂囊状幼虫病毒cDNA作为模板进行检测,其中只有以研究对象基因组DNA为模板时,LAMP扩增才有条带。以上研究提示具有高灵敏度和高特异性的LAMP检测方法是东方蜜蜂微孢子虫检测的一个有效工具,可为后期在养蜂场建立快速有效的检测工具奠定基础。     

乌头基因组DNA提取与RAPD反应体系优化

采用改进方法提取乌头基因组DNA,建立乌头RAPD分析的PCR反应体系,成功地进行了RAPD扩增,筛选出乌头RAPD的最佳方案为:25μl反应体系中包括dNTPs 0.06 mmol·L-1,引物0.2μmol.μL-1,模板DNA40 ng,Taq酶1U,Mg2+ 4 mmol·L-1,10×buffer缓冲液2.5μl,其余部分为无菌超纯水。PCR扩增循环为95℃3 min,38 ℃1 min,72 ℃2min 1次循环;94 ℃=1 min,38℃1 min,72 ℃2 min,45次循环,最后72℃延伸10 min。     

光谱法研究诺氟沙星与DNA的作用

利用荧光光谱和紫外光谱研究了诺氟沙星(NFA)与DNA作用.实验结果表明,DNA以静态猝灭的方式使得诺氟沙星的荧光强度显著降低,NFA在浓度为5.86×10-7～1.95×10-6mol·L-1时,体系的荧光强度与DNA的浓度在一定范围内存在着线性关系,其中在NFA浓度为5.86×10-6mol·L-1时,存在最宽的线性范围,DNA的浓度为2.0×10-5～2.22×10-4mol·L-1.确定了最佳反应条件,该方法简便快速,背景干扰小,对于合成样品中DNA测定结果令人满意.     

东方蜜蜂微孢子虫侵染中华蜜蜂过程中的高表达基因表达谱及其潜在作用

本研究旨在通过高通量测序技术和生物信息学方法探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)过程中的高表达基因(highly expressed gene, HEG)表达谱及潜在作用.利用RNA-seq技术对N.ceranae感染后7d和10d的中蜂工蜂中肠进行测序,通过连续比对东方蜜蜂(Apis cerana)和N.ceranae的基因组,滤除中蜂的数据,得到侵染中蜂工蜂的N.ceranae(Nc1和Nc2)的有效读段数分别为180 237 114和36 054 033条.根据FPKM值大于15的标准,从Nc1和Nc2中分别筛选出1 482和901个HEG.Venn分析结果显示二者的共有HEG数为890个,特有HEG数分别为592和11个.GO分类和KEGG通路富集分析结果显示,上述共有HEG分布于24个功能条目和富集于72条代谢通路.进一步分析发现分别有2个HEG富集在与真菌的应激反应和毒力密切相关的MAPK信号通路.此外,N.ceranae的孢壁蛋白等毒力因子编码基因和ATP/ADP转移酶基因等能量代谢相关蛋白编码基因在侵染过程维持高量表达.通过RT-PCR验证了随机挑选的8个HEG的表达.研究结果提供了N.ceranae在侵染中蜂工蜂过程中的HEG表达谱及潜在作用.     

催化极谱法快速测定硫磺中微量碲

采用硫化铵快速分解硫磺试样,在16.56 mol·L-1NH3·H2O-0.21 mol·L-1酒石酸钠-3.01×10-4mol·L-1Pb-1.50×10-2mol·L-1EDTA-0.12mol·L-1Na2SO3-3.2×10-4mol·L-1HNO3体系中以催化极谱法测定微量碲.极谱峰电位为-1.10V(VS·SCE).碲浓度在4～100ng/mL-1范围内与峰电流有良好的分段线性关系.检出下限为4ng·mL-1.方法的RSD为1.9%～2.3%,加标回收率为90.10%～96.00%.该法操作简便快速,用于硫磺样品的测定结果满意.     

柳树RAPD反应体系均匀设计试验研究

从柳树幼苗的嫩叶中提取基因组DNA作为模板,运用均匀设计方法,获得;柳树RAPD扩增反应的优化体系：25μL反应体系中,DNA模板用量70 ng,引物浓度0.5mmol.L-1,Mg2＋浓度3mmol.L-1,TaqDNA聚合酶用量1.0 U,dNTP浓度0.3mmol.L-1.用16条引物进行验证,证实该体系重复性好、结果稳定.     

一种适于意大利蜜蜂中肠总蛋白提取方法的建立和应用

依次采用不锈钢珠破碎结合IPG裂解液法、液氮研磨结合IPG 裂解液法、液氮研磨结合 PBS 裂解液法和不锈钢珠结合 PBS 裂解液法提取意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,Ap）中肠总蛋白,并通过 SDS-PAGE 对获得的总蛋白进行质量检测。结果显示,与其他 3 种方法相比,利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合 PBS 裂解液法能够提取并获得丰度较高的 Ap 中肠总蛋白,蛋白质种类较多,分子量大小为 18.4～116 kD,样品的电泳条带清晰可见。应用该方法还开展了 Ap 感染东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae,Nc）后中肠组织蛋白质的差异表达分析,结果显示感染 Nc的 Ap 中肠出现了蛋白质的上调表达;同时 SDS-PAGE 结果显示该方法也适用于中华蜜蜂（Apis cerana ceranaFabricius,Api）中肠总蛋白的提取。利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合 PBS 裂解液法提取 Ap 中肠总蛋白方法的建立将有助于对蜜蜂中肠蛋白进行鉴定分析,为深入研究蜜蜂中肠蛋白质组成、功能及其肠道免疫机制奠定基础。
     

黄连基因组DNA提取与RAPD-PCR体系的正交优化研究

采用改进的SDS方法提取黄连基因组DNA,利用正交设计研究方法建立黄连RAPD分析的PCR反应体系,成功地进行了RAPD扩增,筛选出黄连RAPD的最佳方案为:25μL反应体系中包括dNTPs0.12mmol.L-1,引物0.2μmol.μL-1,模板DNA 40ng,Taq酶1U,Mg2+2mmol.L-1,10×buffer缓冲液2.5μL,其余部分用无菌超纯水补平.PCR扩增循环为95℃3m in,38℃1m in,72℃2m in 1次循环;94℃1m in,38℃1m in,72℃2m in,45次循环,最后72℃延伸10m in.     

中华蜜蜂工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的高表达基因分析

为探究高表达基因(highly expressed gene,HEG)在中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫过程的表达谱及作用,利用RNAseq技术对正常中蜂工蜂中肠(Ac7CK和Ac10CK)及N.ceranae胁迫7 d和10 d的中肠(Ac7T和Ac10T)进行深度测序、生物信息学分析和分子生物学验证.共测得1 809 736 786条raw reads,经质控得到1 562 162 742条clean reads. Ac7CK、Ac7T、Ac10CK和Ac10T的共有HEG为2 074个,特有HEG分别为89、283、156和78个.Ac7T和Ac10T的特有HEG分别涉及35和28个功能条目,以及39和37条代谢通路.RT-PCR结果证实了8个共有HEG的真实表达.上述结果表明,宿主的物质和能量代谢、细胞和体液免疫均受到不同程度的激活,二者间存在密切的相互作用.研究结果解析了中蜂工蜂中肠响应N.ceranae胁迫的HEG表达谱及潜在作用.     

微孢子虫感染下意大利蜜蜂谷胱甘肽降解酶基因

【目的】通过生物信息学鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶2(AmCHAC2)，并通过定量PCR分析该蛋白的编码基因〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在意大利蜜蜂组织中的时空表达特征，探讨该基因在蜜蜂抵抗微孢子虫感染中的作用。【方法】采用多重序列比对分析AmCHAC2的氨基酸序列特征和结构域组成；在线预测该蛋白的结构、互作蛋白网络、细胞定位特征和功能；构建系统进化树分析该蛋白的的系统分类和进化关系；实时定量PCR分析〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在供试蜜蜂组织中的时空表达特征；采用试剂盒检测分析供试蜜蜂组织谷胱甘肽含量的表达特征；采用ELISA法检测分析供试蜜蜂中肠活性氧含量。【结果】AmCHAC2由245个氨基酸残基组成，相对分子质量为28.3 kDa，pI为6.71。AmCHAC2为疏水蛋白，不具备信号肽，定位于细胞质。供试蜜蜂在感染东方蜜蜂微孢子虫(Noseama ceranae)14 d后大量死亡，存活率仅为23%；与对照组相比，感染微孢子虫的供试蜜蜂胸部和中肠组织中〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗表达明显上调，GSH含量明显下降，且中肠内活性氧含量明显上升而触发氧化应激。【结论】〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在受到东方蜜蜂微孢子虫感染后表达上调，这可能在意大利蜜蜂抵抗微孢子虫感染过程中扮演着重要角色。