II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型和链球菌混合感染自然病例的临床病理学研究

对经病原鉴定而确诊为猪圆环病毒Ⅱ型和链球菌的混合感染的自然病例进行了系统的临床病理学研究，结果表明：病猪主要出现PMWS，即（1）消瘦、发育迟缓，有的发热，有的贫血，呼吸困难、跛行、多数淤血、出血．（2）间质性肺炎，融合性肺炎，坏死性肺炎，支气管性肺炎．（3）亚急性淋巴结炎或出血性淋巴结炎．（4）轻度非化脓性脑炎．（5）多发性关节炎．（6）间质性肝炎．（7）纤维素性胸膜炎和纤维素性心包炎．（8）间质性肾炎和变质性肾炎．（9）全身性血液循环障碍．上述临床病理变化猪圆环病毒Ⅱ型和链球菌混合感染作用的结果．     

猪圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2007年4月,龙岩市某存栏母猪达200头的规模化猪场,保育栏仔猪出现体温升高,呼吸困难,咳嗽,耳、鼻端、四肢及下腹部皮肤发紫,经临床剖检及病理观察大体判断为圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染,为进一步确诊,进行了实验室诊断.分别设计了PCv2及PRRSV的扩增引物,结果从病例中扩增出相应的产物.通过临床、病理诊断及实验室检测.确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒与圆环病毒2型混合感染.     

内蒙古部分地区猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的血清学调查

应用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法对内蒙古部分地区猪场的182份猪血清进行猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的抗体检测,其中包括母猪、种公猪、哺乳仔猪、生长育肥猪、保育猪.平均阳性感染率为39.6%(72/182),母猪阳性感染率为44.9%(22/49),种公猪阳性感染率为73.7%(14/19),生长育肥猪阳性感染率为38.8%(19/49),保育猪阳性感染率为40.5%(17/42),哺乳仔猪全部为阴性(15).实验检测结果证实,内蒙古地区养猪场存在猪圆环病毒II型(PCV-2)感染,而且比较严重.     

藏猪白细胞介素-12基因表达对猪圆环病毒2 疫苗的免疫增强效应

为研究IL-12基因在猪体内表达对PCV2疫苗免疫应答的调控作用,本研究将藏猪IL-12基因克隆至VR1020载体,壳聚糖包裹重组质粒制备成壳聚糖纳米颗粒(VRIL-12-CNP)并与PCV2疫苗共同接种21日龄断奶仔猪.接种后第0d、7d、14d和28d采集猪前腔静脉血进行血细胞分析、PCV2抗体检测和相关免疫基因表达量检测,并记录体重.结果显示:接种VRIL-12-CNP和PCV2疫苗的实验组猪的CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞和PCV2抗体显著增长(P0.05),TLR2/7、IL-12/4/6/15、STAT1/3和Bcl-2基因的表达量显著高于对照组(P0.05);试验期间实验组体重净增长也明显高于对照组(P0.05).结果表明:VRIL12-CNP能增强PCV2疫苗的先天性和获得性体液、细胞免疫应答,是安全、有效的PCV2疫苗佐剂.     

新疆北疆部分地区猪附红细胞体与圆环病毒混合感染的诊断

分别采集60份新疆北疆地区部分规模化猪场疑似感染PCV-2和附红细胞体病死猪的肺脏及血液,利用PCR方法检测PCV-2部分基因序列,瑞氏染色后光学显微镜观察附红细胞体。结果显示,60份肺脏中,PCV-2阳性29份,阳性率为48．3％,60份猪血涂片中42份呈现附红细胞体感染,阳性率为70％。检出PCV-2的阳性猪血中有25份附红细胞体镜检阳性,说明PCV-2与附红细胞体存在共同感染。     

猪圆环病毒的分子生物学特性及诊断方法

猪圆环病毒(PCV)病是近年来阻碍养猪业发展的重要传染病,PCV因而成为各国学者的研究热点.本文就猪圆环病毒的基因组结构与功能,主要的编码蛋白质及其功能,分子生物学诊断方法等领域的最新研究进展进行了综述.     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

汉滩病毒S基因0.7kb片段与M基因G2片段不同拼接方式嵌合基因原核表达产物的初步比较

比较汉滩病毒S、M基因部分片段的嵌合基因不同拼接方式表达产物的活性。构建了嵌合基因原核表达载体pGEX-4T-1-S0.7G2,并与已构建的pGEX-4T-1-G2S0.7的诱导表达产物进行了比较。结果表明,融合蛋白同时保持亲本蛋白的结合活性,且前者表达产物的结合活性始终比后者低。研究表明,嵌合基因的不同拼接方式对融合蛋白的活性可能有一定的影响。     

中介蝮Asn49-PLA2基因原核表达载体的构建及初步表达

以来自中介蝮(G.intermedius)毒腺cDNA文库的3个新Asn49-PLA2基因(GI4-PLA2,GIs-PLA2及其突变体G15'-PLA2)为模板,用PCR及DNA重组技术,将三个PLA2基因克隆到原核表达载体pQE-30,并在宿主茵E.coli Rosseta(DE3)中进行诱导表达.Bam H Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切及测序结果提示,成功构建了3个原核表达栽体(pQE-30/GI4-PLA2,pQE-30/GI5-PLA2,pQE-30/GI2'-PLA2).SDS-PAGE结果表明,中介蝮的3个Asn49-PLA2基因在大肠杆茵中实现表达,而且在37℃、1mM IPTG的诱导条件下,GI4-PLA2和GI5-PLA2的最佳表达时间为25h,而GI5'-PLA2在15h有较高水平的表达.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段的原核表达

取淋巴囊肿病病毒感染牙鲆组织,蛋白酶K裂解,PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段.构建其原核表达载体,IPTG诱导表达.结果表明,该融合蛋白分子量约70 kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应.为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础.     

牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.     

288株猪圆环病毒的序列比较及遗传进化分析

目的为进一步了解猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的遗传进化规律,为该病的预防和控制奠定基础。方法对来自世界各国的26株PCV1和262株PCV2的全序列用生物软件进行了核苷酸的同源性比较,并对其ORF1和ORF2进行了核苷酸和推导氨基酸的比较。结果从核苷酸水平来看,PCV1与PCV2明显分为两支,PCV1间分布没有规律,而PCV2间又分为以来自美国、加拿大、澳大利亚的序列为代表的亚型Ⅰ和以来自法国和新西兰的序列为代表的亚型Ⅱ;但从氨基酸水平来看,其分型并没有规律可循。从遗传进化树可以看出,PCV2的分布并没有地域性和时限性。数据统计显示,尽管相隔近十年之久,但其同源性并没有发生太大的改变,可见PCV2相当保守。另外对PCV2的碱基和氨基酸突变位点进行统计发现,PCV2序列间更倾向于碱基的颠换,但并无单个碱基和氨基酸的偏好性。结论PCV2相对保守,地域性和时限性分布不明显。     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化.结果显示,可溶性部分以及经2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为150mM.纯化后重组蛋白的纯度在90%以上.     

猪白细胞介素-6基因的原核表达及其活性研究

用DNA重组技术，将已克隆的猪IL－6 cDNA片段插入pGEX-1λT质粒，转化大肠杆菌，以BamHI和Pst I酶切鉴定重组子，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作RT－PCR及SDS－PAGE分析表达情况，从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收融合蛋白，用MTT法测定重组蛋白刺激小鼠脾淋巴母细胞增殖反应的活性，并免疫家兔制备高免血清，得到高效表达猪IL－6的质粒pGPIL-6,RT-PCR确证pGPIL-6在大肠杆菌中能正确转录，经SDS－PAGE分析表达蛋白分子量为49kD，融合蛋白具有较高的促小鼠淋巴细胞增殖反应活性，以此免疫家兔，可制备滴度为1：128 000的兔高免血清。     

SARS病毒E基因的克隆及原核表达

为了得到纯的SARS-CoV E蛋白以进一步研究其功能,通过Touch-down PCR程序,从SARS-CoV WHU cDNA(pMD18-T载体)文库中扩增了E基因,构建了重组质粒pGEX-E,并在Ecoli DH5α中进行了原核表达。SDS/PAGE及Western blot结果表明SARS病毒E蛋白的分子量约5 kDa,较预测的略小,并进一步分析了这种现象产生的可能原因。     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。