产氢菌的16S -23S rDNA间隔区的长度变异性分析

生物制氢细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区碱基序列被测定，利用PCR扩增间隔区DNA，间隔区碱基序列存在长度多态现象．用这一长度多态现象进行产氢发酵细菌的辨认和识别，产氢发酵细菌Rennanqilyf3的16S rRNA gene(rDNA)-23S rDNA间隔区的PCR产品从1270到398bp，共有5个序列，碱基数目分别为1270、398、638、437和436bp。     

采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的初步研究

初步探讨了采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的方法.根据已知细菌16S rDNA序列的高度保守区设计引物,利用PCR法扩增16株已鉴定的鳗鲡病原菌的16S rDNA片段,测序分析后,通过Gen-Bank数据库进行同源性检索,并构建相应的系统发育树.结果表明:16株鳗鲡病原菌均扩增到了400 bp左右的基因片段,其中14株菌的16S rDNA片段序列与网上已发表的同属菌株的同源性为100%,其余2株为99%;8株病原菌被鉴定到种,分别属于嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,其余8株被鉴定到属,分别属于气单胞菌属、假单胞菌属和肠杆菌属;鉴定结果与生化鉴定结果在属的分类单元上的符合程度高达82%.     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

一株嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的16S-23S rDNA间区序列分析及应用

根据细菌的16S rDNA 3'端和23S rDNA 5'端的高度保守区设计引物,扩增了一株中华鳖Trionyx sinensis"红板病"病原菌--嗜水气单胞菌的16S-23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序.用BLAST和DNAstar软件对16S-23S rDNA间区序列以及其内tRNA基因与已发表的嗜水气单胞菌和近缘种的IGSG序列进行比较分析,设计出对嗜水气单胞菌特异的PCR引物,建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法,进行了特异性、灵敏性检测,并用此方法检测了不同的水样.     

rDNA指纹图的建立及其在细菌分类鉴定中的应用

应用PCR技术,从大肠杆菌中分别扩增出16S、23S核糖体RNA基因(rDNA),以[a-32P]bATP经缺口平移法标记rDNA后作为广谱探针.选用BamhⅠ、EcoRⅠ、HndⅢ等不同限制酶,对肠杆菌科细菌及一起沙门氏菌食物中毒暴发分离株进行染色体DNA酶切,凝胶电泳分离各片段后,通过Southem杂交,获得各菌株rDNA指纹图.每个细菌都可以从rDNA的限制性片段长度多态性(RFLP)得到鉴定,rDNA指纹图显示出种特异性,明确地区分出引起食物中毒的可疑传染源.该法特异性强、重复性好,既可用于细菌的分类鉴定,也可作为分子流行病学调查的工具.     

TGGE法对白洋淀底泥细菌种群多样性及动态变化的研究

本文应用PCR-TGGE指纹图谱技术对8个地点、8个月份的白洋淀底泥细菌种群的动态变化及多样性进行了研究。研究结果表明白洋淀底泥细菌的16S rDNA的PCR扩增结果约为230bp,为16S rDNA V3区特异片断。8个地点的白洋淀样品的TGGE条带数目和位置表现出明显差异;同一地点、不同时间的样品TGGE图谱差异不大。     

16S rDNA和recA-gene对乳酸菌Ⅱ32的鉴定

对乳酸菌Ⅱ32进行了生化实验.以菌株Ⅱ32的总DNA为模板,采用细菌通用的引物,对其16S rDNA进行特异扩增,并进行序列测定,将测定结果与GenBank DNA数据库中已知菌种的16S rDNA序列通过BLAST软件进行分析比较,初步确定该菌株为戊糖乳酸菌、植物乳杆菌或类植物乳杆菌.采用recA-gene约300bp的特异扩增片段最终确定乳酸菌Ⅱ32为类植物乳杆菌.     

滇藏地区8种鹅膏菌的ITS序列分析

 对滇藏地区8种鹅膏菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增和测序,用ClustalX(version 1.81)软件对所测的ITS序列进行比对分析.结果表明,除5.8S rDNA(其长度为160 bp)比较保守外,8个不同种的ITS序列在长度和碱基位点上都存在较大差异,其中ITS1区间的片段长度为206～297 bp,ITS2区间的片段长度为191～238 bp.这说明鹅膏属的种间具有较高的遗传多样性.利用MEGA(version 3.1)软件进行聚类,8个鹅膏菌在D=0.14处分成3组,与传统分类有出入.这为鹅膏菌的进一步分类及研究提供了分子依据.     

杨树人工林土壤细菌DNA的提取与扩增

土壤微生物多样性反映土壤生态系统健康程度,对土壤养分循环发挥决定作用,并在很大程度上影响林地生产力.为研究人工林长期经营对土壤微生物多样性的影响,本研究以杨树人工林为研究对象,取连作林地根际和非根际土壤,采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation kit试剂盒提取土壤中微生物基因组DNA,并进行16S rDNA V3区扩增.结果表明:6种杨树人工林土壤中均能提取出微生物基因组DNA,基因组DNA片段大于2 000 bp,且DNA带型清晰完整,无明显降解,为后续土壤细菌的PCR扩增提供了良好模板;6种土壤基因组DNA在电泳图中的亮度不一,其中Ⅰ代林根际土壤(B3)微生物DNA条带最亮,Ⅲ代林非根际土壤(FB18)微生物DNA条带亮度最弱,经检测,B3样品DNA含量约为6.9 ng·cm-3,而FB18仅有2.0 ng·cm-3左右;选用27F/1492R和F338-GC/R518两对引物,采用巢式PCR策略,成功扩增出杨树人工林土壤细菌16S rDNA V3区DNA,片段大小为220 bp左右.     

滇南森林土样中的Actinobacteria的分离、快速鉴别及初步鉴定

Actinobacteria是一类极具开发潜力的微生物资源，Actinobacteria的23S rRNA既有高度的保守性，又有较好的可变性，体外PCR扩增Actinobacteria的23S rDNA的稳定插入片段可有效地对放线细菌进行识别．本研究中结合了16S rDNA部分序列分析对其中9株Actinobacteria菌株进行了初步鉴定，随后又对菌株YIMT0056进行了多相分类学研究，最终确定该菌株是红球菌属的一个新种，我们将其命名为云南红球菌。     

兽疫链球菌磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的分离

根据化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)磷脂酰甘油磷酸合成酶（phosphatidylglycerophosphate synthase, PGPS）基因序列设计引物,通过PCR从兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）基因组中克隆得到开读框为531bp的同源序列pgsa-sz。pgsa-sz的预测编码蛋白含有176个氨基酸残基,分子量19400,等电点8.8,其中含有63个疏水氨基酸,预示其可能的膜结合特性。二级结构预测发现该蛋白含3个跨膜域。此外,该蛋白与S. pyogenes的PGPS具有85％的氨基酸序列相似性。将该蛋白与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PGPS进行序列比对,发现该蛋白包含PGPS中保守的活性位点区域。上述结果表明,pgsa-sz为S. zooepidemicus细胞膜中PGPS的编码基因。     

浅蛤属(Macridiscus)物种特异性线粒体DNA分子标记及其长度多态性和个体内异质性

浅蛤属(Macridiscus)包括3个形态非常相似的物种,即黑浅蛤(M .melanaegis)、等边浅蛤(M .multifarius)和半步目浅蛤(M .semicancellata),其中前二者为同域分布.根据形态学特征,浅蛤属物种较难区分.本研究以改进的CTAB法提取浅蛤个体基因组DNA 后,用引物Macr_CO1_F16834和Cytb_Macr_R2PCR 配对进行聚合酶链式反应(PCR),扩增线粒体DNA控制区至细胞色素b基因(Cytb)的DNA 片段并进行序列测定,结果发现在黑浅蛤控制区偏3′端,存在该种特有的长度为363bp的数目可变串联重复序列(variablenumberoftandemrepeat,VNTR),种内因该VNTR出现1~3次不等的串联拷贝,而表现出广泛的长度多态性和个体内线粒体异质性现象,这是目前在动物线粒体控制区中发现的最大的VNTR;在半步目浅蛤的控制区的偏3′端,则同时存在14和17bp的2个较短的VNTRs,该物种也因这2个VNTRs的拷贝数目不同,而存在广泛的长度多态性;而等边浅蛤的该段序列长度保守,没有与其他物种共享的VNTR.以该段序列作为分子标记,运用PCR技术能够快速准确地识别浅蛤属物种.      

尼罗罗非鱼主要组织相容性复合体IA基因克隆与多态分析

采用touchdownPCR和RACE技术,获得了两条尼罗罗非鱼MHCIA基因3’端的新序列,其长度均为957bp,分别命名为orni—DAA$0101和orni—DAA 0102,其分别编码了两种新发现的等位基因亚型。两条新序列均包含666bp的CDS区和291bp的3’-UTR区,CDS区包含了部分多肽结合区、全部的IGC区以及跨膜区和胞质区同源性比对显示,cDNA序列分别在388bp和426bp处发生了碱基转换,而其编码的氨基酸序列在第130位点存在谷氨酸与赖氨酸的差异．首次发现相对保守的IGC区也存在变异．研究结果对于揭示尼罗罗非鱼MHCIA基因的多态性及其与高抗病性的相关性有重要价值。     

以 16S-23S rDNA 间区序列为目的基因设计 PCR 引物鉴定多杀巴斯德氏菌

多杀巴斯德氏菌是养殖动物(鸡,猪,牛等)的重要致病菌.本研究以16S-23S rDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌.通过对多杀巴斯德氏菌ITS-IA(含有tDNA-Ile和tDNA-Ala的16S-23S rDNA间区序列)的测序和与GenBank中序列的BLAST,设计筛选了一对特异引物PS-F/PS-R.对引物的特异性和有效性,用PCR方法进行了验证.结果表明:所有的多杀巴斯德氏菌标准菌株和分离菌株都能被检出,而全部39株非多杀巴斯德氏菌都没有扩增出特异性条带.其检测灵敏度能达到102CFU/mL.研究结果表明,发展了的PCR鉴定方法是省时的和可靠的,整个过程只需要20 h,而传统的鉴定方法需要至少5 d的时间.     

基于groEL基因序列鉴定丹毒丝菌属菌种

对4株红斑丹毒丝菌的16SrRNA基因和groEL基因进行测序及系统发育分析,探讨groEL基因序列分析法在丹毒丝菌属菌种分类鉴定中的应用.测序结果表明,4株红斑丹毒丝菌groEL基因长度为1 614bp,编码由537个氨基酸残基组成热休克蛋白HPS60,与红斑丹毒丝菌ATCC19414株和扁桃体丹毒丝菌ATCC43339株groEL基因的同源性分别为99%和86%,而16SrRNA基因长度为1 351bp,与红斑丹毒丝菌ATCC19414株和扁桃体丹毒丝菌ATCC43339株的同源性均为99%.系统发育分析结果表明,groEL基因比经典的16SrRNA基因序列分析分辨率高,可适用于红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌的分类鉴定.     

青海柯柯盐湖16株细菌的ARDRA筛选及系统发育初步分析

 从青海柯柯盐湖泥样中分离的16株细菌,用2种限制性内切酶酶切进行ARDRA分析,其中12株菌的酶切带谱有较大差异.根据这12株菌的16SrDNA序列进行系统发育分析结果表明,12株菌有11株分布于芽孢杆菌科中的Halobacillus,Gracibacillus,Amphibacillus,Virgibacillus,Bacillus,Salibacillus和1个潜在的新属中,另1株属于Proteobacteria的Gamma亚群Halomonadaceae科,Halomonas属.而且16SrDNA系统发育分析提示这些菌株中存在3个新种和1个新属的可能.本研究得出的结论为:应用ARDRA来初步筛选菌株是可行的;青海柯柯盐湖这一极端环境中存在较丰富的新的芽孢菌种类.     

An rpoB gene-based PCR-DGGE method for simultaneous detection of multiple Vibrio species

Using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) targeting the RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene, a simultaneous detection method for Vibrio species was established. rpoB gene-based PCR-DGGE was carried out with eight Vibrio Reference strains (each from different species), mixed sample (including these Vibrio Reference strains),two non Vibrio strains, four environmental Vibrio strains, and three unidentified environmental strains. For comparison, 16S rRNA gene-based PCR-DGGE of the eight Vibrio Reference strains was performed with universal primers. In addition, three unidentified strains were identified by 16S rRNA and gyrB gene sequencing and API20E system in order to confirm the accuracy of rpoB gene-based PCR-DGGE detection. Results revealed that rpoB-based PCR-DGGE could well discriminate eight Vibrio Reference strains and could not discriminate different strains within the same species. The bands derived from two non Vibrio strains could not match with any bands in Reference marker. Meanwhile, 16S rRNA gene-based DGGE failed to distinguish these Reference strains. Furthermore, four out of eight Vibrio species exhibited heterogenous bands in 16S rRNA gene-based DGGE. Sequencing and API 20E identification of unidentified strains coincided with the detection by rpoB gene-based PCR-DGGE. The results demonstrated that rpoB-based PCR-DGGE provided a rapid and efficient method for simultaneous detection of multiple Vibrio species, which can avoid the limitations inherent in 16S rRNA gene-based PCR-DGGE.     

中国明对虾与5种虾类线粒体16S rRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

采用PCR扩增和序列测定等技术,对中国明对虾（Fennerpenaeus chinem如）线粒体DNA16S rRNA和细胞色素氧化酶I（COI）基因片段进行了初步研究,分别得到16S rRNA和COI 2个基因片段的碱基序列,其中16S rRNA基因片段的大小为515bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为66．47％和33．53％;COI基因片段的大小为472bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为62．50％和37．29％．在2种基因片段中,AT的组成明显高于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S rRNA和COI基因片段的研究结果相似．通过对中国明对虾16S rRNA和COI 2个基因片段遗传特征的研究,16S rRNA只有8处核苷酸的碱基在4个群体间表现出差异,COI基因片段中共检测出24个多态性核苷酸位点,其种内变异较低。另外,将本研究所得序列与GenBank中对虾科5个种的16S rRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类相一致．     

Differentiation of Epinephelus moara from E. bruneus by improved nest-tetra-primer-specific PCR

Epinephelus moara and E. bruneus are closely related species in the genus Epinephelus (Perciformes, Serranidae). Their morphological similarity, changing color pattern at different stages and living conditions make them difficult to be differentiated. To identify these two species, an improved nest-tetra-primer-specific PCR assay was developed. Three specific molecular markers, the control region NC1 (394 bp), species-specific internal region ND2-M (268 bp) and ND2-B (122 bp), were identified in the mitochondrial ND2 gene from these two grouper species. Five markers were also discovered in the ITS1 regions of their nuclear ribosomal DNA, which were the control regions NC2 (588 bp) and NC3 (563 bp), and species-specific internal regions rDNA-M (426 bp), ITS1-M (488 bp) and ITS1-B (304 bp). This method provided a highly specific, precise, reliable and rapid molecular marker technique to discriminate between the two grouper species, as well as a new way of DNA identification to differentiate closely related species in fishes.