动物源粪肠球菌快速鉴定方法的建立

为了快速、准确鉴定动物源粪肠球菌,本研究采集猪、牛、羊、鸡和马等不同动物源的粪样194份,接种到链球菌选择培养中进行分离和纯化,采用PCR方法扩增分离株中的tuf基因,采用常规微生物学方法检测其生理生化和培养特性。结果表明,194份粪样中分离到285株肠球菌,其中200株为粪肠球菌。该程序可在60 h内完成,为快速准确的鉴定粪肠球菌提供了一种可参考的方法和程序。     

致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因的克隆与生物信息学分析

为研究致羔羊脑炎粪肠球菌分离株表面蛋白EF3183基因的结构及功能,采用PCR方法扩增EF3183基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其分子结构,推测其生物学功能,并构建系统进化树。结果显示:成功获得了长1060 bp的表面蛋白EF3183基因;经生物信息学分析,此序列包含有1个1056 bp的完整开放阅读框,编码351个氨基酸;无信号肽;有2个跨膜区;抗原表位预测显示表面蛋白EF3183有15个抗原表位;系统进化树分析显示致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因与粪肠球菌v583的EF3183基因的进化距离最近。本研究成功获得了致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

乳酸菌表达质粒的构建

粪肠球菌是乳酸菌的一个属．采用生物信息学方法,预测了粪肠球菌AS1．2984基因组中乳酸脱氢酶和三磷酸甘油醛脱氢酶的组成型启动子序列．设计引物通过PCR扩增得到这2段启动子序列,并克隆到乳酸菌一大肠杆菌穿梭质粒pNZ8037上,在启动子下游接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建乳酸菌的组成型蛋白表达质粒．通过电转化将上述改造过的pNZ8037质粒导入粪肠球菌中,在共聚焦显微镜中可以观察到绿色荧光蛋白的表达．在乳酸菌MRS培养基中加入乳酸、盐酸、氢氧化钠等试剂,发现可以调节绿色荧光蛋白的表达量．     

粪肠球菌中具有启动功能的DNA片段的捕获及鉴定

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一系列具有启动功能的DNA片段,将包含克隆片段的pNZ-P-bla6质粒电击转化粪肠球菌,培养转化子并检测其抗氨苄强度,结果表明其抗氨苄强度大于Nisin诱导的含pNZ-bla质粒的粪肠球菌.表明克隆的功能片段启动能力强于PnisA.在pNZ-P-bla6的启动功能片段下游Sau3AⅠ和EcoRⅠ之间接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建表达绿色荧光蛋白的质粒载体pNZ-P-gfp并导入粪肠球菌中,共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达.     

肠球菌临床耐药性分析及耐药基因vanM在屎肠球菌中的检测

目的了解肠球菌临床分离株耐药性及vanM基因在屎肠球菌的分布情况,为临床合理用药及探讨耐药机制提供依据.方法采用VITEK60全自动微生物分析仪对肠球菌进行鉴定及药敏试验,按NCCLS/CLSI标准判断并统计分析结果;PCR法检测耐万古霉素、替考拉宁菌株中的耐药基因vanM,并对阳性基因进行测序,分析耐药基因与耐药性的关系.结果临床分离肠球菌共506株,其中屎肠球菌277株,粪肠球菌229株.尿液标本来源比例最高,为167株（33%）;粪便标本114株（22.5%）;痰液标本78株（15.4%）;胆汁标本57株（11.3%）;脓液标本54株（10.7%）;其他来源36株（7.1%）.药敏结果显示：肠球菌对大部分临床抗菌药高度耐药,屎肠球菌对β-内酰胺类抗菌药物（氨苄西林）、喹诺酮类（左氧氟沙星）、糖肽类（万古霉素、替考拉宁）的耐药率明显高于粪肠球菌（P〈0.05）.vanM基因在耐万古霉素菌株中的检出率为100%,耐替考拉宁菌株检出率为90%.结论屎肠球菌可引起临床各类感染,屎肠球菌对大多数抗生素的耐药率明显高于粪肠球菌,且呈多重耐药趋势.vanM基因可能在糖肽类药物万古霉素、替考拉宁耐药机制中发挥重要作用.     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序，测序结果在GenBank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的，这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础．     

藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析

为解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及其基本生物学特征,无菌采集12头健康藏绵羊新鲜粪便,分离培养及纯化乳酸菌株,并通过16S rDNA序列扩增和测序进行分子鉴定.结果显示:从12个样本中共分离纯化出19株乳酸单菌,分属于7个属,其中鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌及植物乳杆菌所占分离比例较多.该结果为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群种类及藏绵羊益生菌制剂的开发提供了基础.     

致羔羊脑炎粪肠球菌的分布规律

为了确定致羔羊脑炎粪肠球菌在人工感染小鼠体内的分布规律,本研究采用粪肠球菌人工培养物腹腔注射小鼠,无菌采集死亡或濒临死亡小鼠脏器,利用已建立的PCR技术对人工感染肠球菌小鼠主要脏器进行检测,结果显示在受检的6种组织中,即肝、脾、心、脑、肾均能扩增出与预计大小112bp一致的粪肠球菌的DNA阳性条带。与细菌分离结果一致。     

重症监护病房的肠球菌种类及其耐药性分析

目的:了解我院重症监护病房肠球菌的种类及对其耐药情况进行分析.方法:用法国梅里埃公司生产的全自动细菌分析仪Vitek-32进行肠球菌鉴定和K-B法进行药敏试验.结果:113株肠球菌中以粪肠球菌和屎肠球菌为主,共94株占总数的83.18%,其中粪肠球菌63株占55.75%,屎肠球菌31株占27.43%.肠球菌对替考拉宁和万古霉素的耐药性最低,但屎肠球菌对12种抗菌药物的耐药性明显高于粪肠球菌.结论:临床对肠球菌的检测应达到种的水平,屎肠球菌对抗菌药物的耐药性较粪肠球菌为高,已经检测出对糖肽类抗生素万古霉素及替考拉宁耐药的肠球菌,值得重视.     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序．测序结果在Gen—Bank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的．这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础。     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

西红花酸合成酶（7，8-二加氧酶）片段的克隆及在大肠杆菌中的表达与检测

根据已发表西红花酸合成酶（7,8-二加氧酶）基因序列设计PCR特异性引物,从西红花柱头总RNA中扩增并克隆到一段长为1.2 kb的片段.测序结果表明该片段含有两个序列.一个与已知西红花酸合成酶基因序列高度同源(同源性99％),命名为CsZCD;另一个的同源性为96%,命名为CsZCD-NEW.将CsZCD-NEW片段克隆到表达载体pQE31上,得到重组质粒CsZCD-NEW-pQE31.经IPTG诱导,重组质粒在E.coli M15中表达.     

莴苣黄化病植原体的分子鉴定

为了明确新疆莴苣黄花病植原体的分类地位,采用巢式PCR和PCR技术对表现黄化症状的莴苣植株分别利用植原体16S rRNA基因和tuf基因通用引物P1／P7、R16F2n／R16R2和fTufu／rTufu进行扩增,得到大小约1．2kb和0．8kb的特异性片段,对所得片段克隆、测序和序列分析。结果表明：它们分别和榆树黄化组（Elm yellows group）成员的16S rRNA基因、tuf基因同源性最高,分别高于98．6％和92．4％。基于16S rRNA基因和tuf基因的系统进化树分析显示,其均与植原体16Sr V组成员位于同一分支上。对16S rRNA基因的iPhyClassifier分析结果表明,其与榆树黄化组B亚组（16Sr V—B）代表株系JWB（AY197661）具有相同的酶切图谱。所有结果表明莴苣黄化病植原体（LSY）属于榆树黄化组B亚组（16Sr V-B）。     

黑线仓鼠催乳素受体（PRLR）基因部分序列的克隆与序列分析

采用基因克隆方法首次扩增出黑线仓鼠催乳素受体（Prolactin Receptor,PRLR）基因5’端部分序列（GenBank登录号为EU826030）,测序结果表明该片段的有效长度为379bp,包含部分5’调控区、exonl及部分intron1．该序列与其它物种相应区域的同源性比较结果：黑线仓鼠与人、大鼠、小鼠、狐猿、黑猩猩、类人猿PRLR基因核苷酸序列的同源性为82．1％-93．4％;exon1序列的同源性为79．8％-91．4％．系统进化分析与物种亲缘关系的远近一致,同时证明PRLR基因exon1有较大的可变性,因此认为成功克隆了黑线仓鼠的PRLR基因的部分序列．该研究所得到的PRLR基因序列可用作研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记．     

黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶基因（MnP2）的克隆

应用RT-PCR技术,从黄孢原毛平革菌5.766（Phanerochaete chrysosporium）总RNA中成功扩增出预期大小约为1.3 kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入PUC19载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得锰过氧化物酶（MnP2）基因的克隆。序列分析表明,扩增的MnP2基因片段其cDNA长度为1 149 bp,编码358个氨基酸,与其它已发表文献报道的MnP2序列一致,与其同工酶MnP1和MnP3的核苷酸同一性分别为81%和66%。     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

胰岛自身抗原GAD65片段和胰岛素B链基因共表达DNA疫苗的构建与表达

构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶（ glutamic acid decarboxylase, GAD） 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗,并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA,overlap法再分别与信号肽基因进行拼接,将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA．1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,脂质体体外转染COS-7细胞,Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建,为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析

参考牛种布鲁氏菌的GroEL（热休克蛋白）基因设计引物,扩增出新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因片段,将其片段克隆到T载体上测序。结果表明：新疆源布鲁氏菌GroEL基因片段长1641bp,编码546个氨基酸,与羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）以及牛种（B．abortus）GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％,推导的氨基酸序列同源性在99％以上,显示了很强的保守性。     

广西巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA克隆和序列分析

目的通过RT-PCR扩增广西巴马小型猪Myostatin cDNA序列,经过连接、转化、克隆测序后,与NCBI中发表的猪Myostatin序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪Myostatin的cDNA序列结构特点及与其他物种间的聚类关系,为日后构建Myostatin高效表达载体及进一步研究Myostatin对广西巴马小型猪肌肉生长的影响奠定基础。方法以广西巴马小型猪的肌肉组织总RNA为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),利用合成的特异性引物,扩增得到巴马小型猪肌肉生长抑制素(Myostatin)cDNA的全序列。该扩增片段经纯化后,连接到pMD18-T载体上扩增,经一系列鉴定后,测序。结果本实验克隆到巴马小型猪Myostatin基因cDNA序列长度为1128 bp,与GenBank报道的猪Myostatin基因cDNA序列同源性高达99.7%,与人、奶牛、家鼠等物种的cDNA序列间同源性可达到92.3%以上,证明Myostatin基因具有较高的保守性。同时发现广西巴马小型Myostatin基因cDNA序列有三处存在碱基突变,两个为同义突变,一个为错义突变。