Bacillus subtilis碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

针对实验室筛选获得的Bacillus subtilis,设计2对引物扩增出编码碱性果胶酶基因pelG1和pelG2,酶切后分别连接到大肠杆菌分泌表达载体pET-22b(+)多克隆位点上得到重组载体,在BL21( DE3)中表达并进行了分析.     

杀虫球孢白僵菌菌株筛选及类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆

在水稻叶蝉僵虫中分离出一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana),根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列同源性设计引物,采用RT-PCR法得到一个球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cD-NA片段.利用表达载体pET28a( ),在大肠杆菌中表达了CDEP2蛋白.     

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.     

GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征;采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2％的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.     

TGEV截短S基因片段在多酵母表达系统中的表达

在多酵母表达系统中表达了含有猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段.经检测表明,不同类型酵母表达系统蛋白表达量和抗原性差异不大,研究中获得的重组蛋白为建立TGE血清学检测方法提供了必要的物质基础.     

果蝇血液标记基因srp原核表达质粒构建及多克隆抗体制备

果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯...     

人类心脏特异表达基因pygol的克隆与功能研究

心血管疾病已经成为危害人类健康和生命的头号杀手.研究发现,各种心血管疾病与心脏心律失常和心力衰竭有关.wg信号途径直接调控心脏前体细胞的形成和特化过程.pygo基因是近几年在果蝇中新鉴定的一个参与wg信号途径的基因,但pygo是否参与心力衰竭发生的过程尚不得而知.利用RT-PCR的方法,克隆出人类pygo1基因的全长.该基因位于15q21.1,蛋白342～396区域包含一个PHD结构域.亚细胞定位分析表明,pygol蛋白分布在细胞核中.利用心力衰竭果蝇模型,通过电场对正常和突变基因的成蝇瞬间中断其心脏功能,记录果蝇心衰率的表现,研究pygo的功能.结果表明,果蝇pygo基因突变杂合子的心脏停止跳动和心脏纤维性颤动的比例达32.3%,比对照的高15.6%,表明Fygo与心力衰竭的发生有关.     

鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备

肌球蛋白重链(MyHC)是肌肉中的主要结构和功能蛋白,在肌肉收缩过程中起关键作用.根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物,将该基因片段亚克隆到pET-32a质粒,构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h可大量表达融合蛋白.将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA和免疫组化测试结果表明:此抗体有较好的特异性和抗原性.鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础,为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持.     

人类心脏特异表达基因pygo1的克隆与功能研究

心血管疾病已经成为危害人类健康和生命的头号杀手．研究发现,各种心血管疾病与心脏心律失常和心力衰竭有关．wg信号途径直接调控心脏前体细胞的形成和特化过程．pygo基因是近几年在果蝇市新鉴定的一个参与wg信号途径的基因,但pygo是否参与心力衰竭发生的过程尚不得而知．利用RT-PCR的方法,克隆出人类pygo1基因的全长．该基因位于15q21．1,蛋白342～396区域包含一个PHD结构域．亚细胞定位分析表明,pygo1蛋白分布在细胞核中．利用心力衰竭果蝇模型,通过电场对正常和突变基因的成蝇瞬间中断其心脏功能,记录果蝇心衰率的表现,研究pygo的功能．结果表明,果蝇pygo基因突变杂合子的心脏停止跳动和心脏纤维性颤动的比例达32．3％,比对照的高15．6％,表明pygo与心力衰竭的发生有关．     

小鼠Shh蛋白N端基因的克隆与原核表达

从小鼠(C57BL/6)10.5d胚胎中提取总RNA经RT-PCR扩增出编码小鼠Shh基因N端cDNA序列,克隆到大肠杆菌表达载体pQEN3构建重组表达质粒pQEN3-Shh-N.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol/L IPTG诱导,在SDS-PAGE上检测到20kDa目的蛋白带,与Shh N端蛋白预期大小一致,其蛋白表达量达到了全菌总蛋白的约30%.重组蛋白经Western blot鉴定结果显示,在20kDa处出现单一的显色条带,说明表达的重组蛋白为Shh N端蛋白,为研究Shh蛋白N端与毛发生长的功能奠定了基础.     

杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备

目的:克隆和表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multieapsid nueleopolyhedrovirus,SeMNPV) ORF29全长基因(Se29),制备SE29蛋白的多克隆抗体,方法:用PCR的方法扩增得到Se29基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌B...     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

郁金香ACC氧化酶基因RNAi表达载体的构建

为了构建郁金香ACC氧化酶基因的RNAi表达载体.采用Trizol法提取了郁金香花瓣总RNA,根据郁金香ACC氧化酶基因编码区序列,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,成功地扩增得到了郁金香ACO基因保守片段.将此片段以正向和反向插入到中间载体pBSin内含子的两端,构建成发卡结构的RNA片段,利用pCAMBIA35S-1301作为桥梁载体,构建了带发卡结构的RNAi表达载体pCAMBIA-ACO.     

金鱼胰岛素样生长因子2基因克隆与组织表达

采用PCR方法,扩增并克隆了金鱼的IGF2基因.序列分析结果显示:金鱼的IGF2基因共包括有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长606 bp,编码201个氨基酸;编码序列与斑马鱼有85%一致性;蛋白质序列与斑马鱼的有80.9%的一致性.RT-PCR证明金鱼IGF2基因在鳃、心脏、肾、肌肉、尾鳍、雌雄性腺等组织中均有表达.     

黄鳝α-L-岩藻糖苷酶基因克隆及其在雌雄个体间的表达分析

FUCA1是糖基水解酶家族的成员之一,参与糖蛋白、糖脂等生物活性大分子的分解代谢反应.为了进一步了解α-L-岩藻糖苷酶在鱼类生殖发育中的功能,首次分离了黄鳝FUCA1基因,利用在线软件SMART对所克隆出来的FUCA1基因部分核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行对比分析,其结果表明该序列包含了3个跨膜结构域和4个低拷贝区域.通过RT-PCR检测了FUCA1在黄鳝性腺组织特异性表达状况,FUCA1基因在黄鳝雌性性腺中的表达量高于在雄性性腺的表达量.FUCA1基因在黄鳝雌雄个体间的差异性表达表明,FUCA1基因可能参与黄鳝性逆转生殖发育调控.