Increase Renaturation Yield of Reteplase Using the Recombinant Human Protein Disulfide Isomerase

Reteplase, the recombinant type of novel tissue plasminogen activator (t-PA) variant, is a promising thrombolytics in clinics. Expressed in the form of an inclusion body, reteplase consists of about 40% of the total intracellular proteins of Escherichia coli. The recombinant human protein disulfide isomerase (rhPDI) is used to increase the chance for the correct matching of the 18 hydrosulfide groups of the reteplase molecule in the renaturation process and it increase is the reteplase renaturation yield from 1%-2% to 15% - 20% with a the purity about 99% and the specific activity of 5(105 IU/mg is reached.This novel method can reduce significantly the cost of production.     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

去B链羧端三肽人胰岛素原的基因构建和表达

用改进的寡苷酸诱导 突变法将人胰岛素原基因（ＢＣＡ）删除编码Ｂ链羧端三肽的碱基片段，得到去Ｂ链羧端三肽胰岛素原的基因（Ｂ＾－３ＣＡ）。为了便于表达产物的蛋白质后加工，又用ＰＣＲ的方法在Ｂ链Ｎ端起始Ｍｅｔ与Ｐｈｅ密码子之间增加了编码Ｌｙｓ的３个碱基，得到改造后基因ＬＢ＾－３ＣＡ，将ＬＢ＾－３ＣＡ克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌系统中热诱导表达，表达率为１２％。表达产物经蛋白质后加工，得到的去     

人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。     

人心脏特异性同源异型框基因在大肠杆菌中的表达

Ｈｕｍａｎｃａｒｄｉａｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｅｏｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎ (ｈＣｓｘｏｒＮｋｘ2 .5 )ｅｎｃｏｄｅｓａｈｏｍｅｏｂｏｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｏｆ32 3ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｘｃｙｓｔｅｉｎｅｓ ,ａｎｄｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｔｈｒｅｅｄｏｍａｉｎｓ :ｔｈｅＴＮ ｄｏｍａｉｎ ,ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｄｏｍａｉｎａｎｄＮＫ2ｂｏｘ[1] .ＨＣｓｘｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｅａｒｔｉｎａｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｍａｎｎｅｒｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｄｅｖｅｌｏ…     

二硫键寡核苷酸Microarray用于丙型肝炎病毒检测及HCV1b分型的研究

利用二硫键法制作寡核苷酸DNA Microarray,并将该技术应用到HCV检测中,建立了一种快速、灵敏、安全的寡核苷酸DNA Microarray丙肝病毒检测体系。该体系还可同时对占中国丙肝病毒75％左右的HCV1b亚型进行分型。另外,在丙肝病毒基因组RNA反转录的过程中采用随机引物,从而为进一步的多种肝炎病毒的寡核苷酸DNA Microarray混合检测奠定了基础。     

重组羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用

用RT-PCR方法克隆了大鼠羧肽酶原B的cDNA编码序列,将其重组到原核表达质粒pT7-473中,并在大肠杆菌中以包涵体方式获得高表达。SDS-PAGE电泳及灰度扫描显示表达量达菌体总蛋白的35％,表达产物融合了表达质粒上的6His。在变性条件下,经Ni-NTA柱纯化,得到羧肽酶原B,在复性液中进行稀释复性后,胰蛋白酶切得具酶活性的羧肽酶B,然后经DEAE-FF分离纯化获得较纯的羧肽酶B(28．5mg／L),比活为13．5u／mg。用RP-HPLC分析胰蛋白酶 羧肽酶B酶解胰岛素原C肽三聚体的酶解产物,证明该重组的羧肽酶B可替代提取的羧肽酶B应用于胰岛素原C肽的制备工艺中。     

相转移催化合成二二茂铁丁基二硫醚

采用相转移催化剂、4-氯丁基二茂铁和二硫化钠溶液反应合成了二二茂铁丁基二硫醚,考察了相转移催化剂的种类、原料摩尔比、反应温度等对反应的影响.通过正交实验法得到的最佳反应条件为:以TBAB为相转移催化剂,反应温度为45 ℃,三氯甲烷为溶剂,n(Na2S):n(S):n(FcCH2CH2CH2CH2Cl)=1.6:1:1,二二茂铁丁基二硫醚的产率为91.7%,而且该方法反应速度快、操作简单.通过元素分析、IR、1HNMR确定了产物的组成和结构.     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

纳米二硫化钼的制备及AFM表征

利用硫化铵与钼酸铵为反应物,在适宜的分散剂与超声帮助下,通过快速液相沉淀法制备出三硫化钼,再通入高纯氢气,将三硫化钼加热分解,制备出二硫化钼。X射线衍射结果表明获得的三硫化钼是典型的非晶态MoS3,二硫化钼为2H-MoS2;通过原子力显微镜发现,制备的二硫化钼的平均粒径为70nm左右。     

人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定

构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原（Proinsulin）的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM－T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组载体pcDNA3.1( )／Proinsulin,测序后在真核细胞COS－7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸（C肽区）有一CAG（Glu)→CGG（Arg）的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS－7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。     

2,2''''-二苯基二硫的间接电解氧化合成

以KJ—NaI为间接电解质，丙酮为溶剂，用间接电解氧化的方法对硫酚进行偶联，高产率地得到了偶联产物2，2’-二苯基二硫(Ph2S2)．     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

单分散聚苯乙烯/二硫化钼纳米复合微球的制备与分散性

以二硫化钼为核,聚苯乙烯为壳,通过种子乳液聚合方法,成功制备了具有核壳结构的聚苯乙烯/二硫化钼(PS/MoS2)有机-无机纳米复合微球。利用紫外可见吸收光谱、透射电镜、扫描电镜、能量色散谱仪等多种方法,对PS/MoS2纳米微球的形貌、结构进行了表征,同时,利用分散性试验考察了PS/MoS2纳米微球在油溶性单体双环戊二烯(DCPD)中的分散性。试验结果表明:聚苯乙烯包覆在MoS2的表面,形成核壳结构;纳米粉体呈球形且粒径尺寸均一。分散性试验表明PS/MoS2纳米微球在DCPD中具有极佳的分散性。     

聚乙烯/纳米二硫化钼复合材料电性能

采用熔融共混的方法制得聚乙烯／纳米二硫化钼复合材料，研究该复合材料的电性能及其微观形貌,结果表明，当二硫化钼质量分数大于15％时，体系的电阻明显下降，复合材料的渗滤阀值为15％；二硫化钼均匀分散于聚乙烯基体中，二硫化钼导电颗粒相互接触，形成链状导电网络．     

PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

为了研究蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)在T细胞受体(T cell receptor, TCR)信号通路中的具体功能,利用电穿孔法将T 细胞内的PDIA3蛋白水平敲低,通过Western blotting检测ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)的磷酸化修饰水平, 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)实验检测细胞因子IL-2的分泌情况,流式细胞术分析分化抗原簇69(cluster of differentiation 69, CD69)表达水平及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路.结果显示:T细胞中PDIA3蛋白下调后导致ZAP70蛋白的磷酸化水平、CD69表达和IL-2的分泌都明显降低,并且影响了NF-κB信号通路,表明PDIA3蛋白对T细胞的活化有促进作用,参与T细胞TCR信号通路的调控,为进一步深入研究PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用打下了基础.     

从生产促进剂M废树脂中制取促进剂DM

以工业生产促进剂M的废树脂为原料,经过打浆,甲苯萃取、碱溶解、双氧水氧化合成了促进剂DM,平均收率8.3%,初熔点167.1℃,达到国标(GB11408-89)一等品标准.考察了不同分散剂对制备促进剂DM收率的影响,挑选脂肪酸聚氧乙烯酯(99#)作为分散剂,考察反应温度、双氧水滴加时间、反应时间等因素对合成促进剂DM的影响,找到合成促进剂DM的最佳工艺条件:反应温度60℃,双氧水滴加时间40min,反应时间2h,分散剂、双氧水、EDTA的质量分数分别为1%,27%,5%,M的质量浓度为0.15g/mL.     

化学键极性程度的定量方法

本文第一部分对化学键极性程度的定量判别方法做了简要回顾;第二部分作者定义了极化国子和变形因子两个物理量,计算了常见阳离子的极化因子及阳离子的变形因子大小,并提出了判断化学键极性程度的物理模型,计算了91个二元化合物分子中化学键的的离子性成分。