水稻S5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料，构建了一个覆盖9倍核基因组的cosmid库，其平均插入片段约40kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC23D12的R末端为探针，从cosmid库中筛选得到一个阳性克隆R2I19（－32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱，初步确定为S5区侯选克隆。对该克隆的2个TAC亚克隆TRW1510（－15kb)及TRW1517(-15kb)进行了初步的生物信息学分析，证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性，并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

水稻线粒体atp6基因的克隆及其结构分析

以玉米线粒体ａｔｐ６基因为探针所作的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂文结果显示，水稻野败型细胞质雄性不育系与其保持系（珍汕９７Ａ，Ｂ）的ａｔｐ６基因存在结构上的差异。不育系只有一个ａｔｐ６基因拷贝，而相应的保持系却有两个拷贝．从保持系线粒体ＤＮＡ的Ｌａｍｄａ ＥＭＢＬ３基因文库中筛选出了以上两个ａｔｐ６基因克隆，并根据制作的物理图谱将它们分别定位在２．７５ｋｂ的ＰｓｔＩ／ＰｖｕⅡ和１．６３ｋｂ的Ｓａｌ／ＥｃｏＲ     

水稻S5-ORF3蛋白质的进化分析

生殖隔离在形成新物种和物种同一性的保持中有重要作用,因而在水稻优化育种中有重要的意义。S5位点是一个已克隆的控制水稻生殖隔离的基因,它产生的S5-ORF3,ORF4和ORF5蛋白质共同调控着indica-japonica杂交后代的育性,特别是S5-ORF3蛋白质在打破水稻亚种indica-japonica之间的生殖隔离与促进物种间的基因交流中发挥重要作用。针对S5-ORF3的进化分析对于研究它的功能和起源很重要,但目前尚无报道。本文基于序列和进化分析,提出S5-ORF3为一种定位在内质网中的新的HSP70家族蛋白,但缺乏HSP70的C端的多肽结合结构域,推测S5-ORF3可能通过影响alpha-淀粉酶的合成来作用于内质网压力;找到了ORF3的19条同源蛋白,并用极大似然算法构建了可靠的进化树,发现水稻的S5-ORF3与节节麦的luminal-binding蛋白进化关系最为密切;作了置信度100%的S5-ORF3蛋白质的三维结构预测,预测了居中的配体绑定位点;发现了水稻的S5-ORF3与其他HSP70蛋白相比独特的基序,为进一步研究S5-ORF3的作用机理和演化历史提供了线索和数据支持。     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

水稻OsPPDK基因的克隆及生物信息学分析

利用比较基因组学方法,通过小麦TaNAM基因序列来设计引物,在早衰水稻品系金23B中寻找TaNAM的同源基因.对获得的c DNA片段进行序列比对分析,发现其与丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase,PPDK)基因高度同源,因此将其命名为OsPPDK(Oryza sativa PPDK).为进一步探索OsPPDK基因的功能及其与叶片衰老的关系,根据水稻预测OsPPDK基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆出OsPPDK基因的编码区,并进行生物信息学分析.结果表明:该基因全长为3 515 bp,包含一个完整的ORF,编码区长2 844 bp,编码947个氨基酸,分子量为102. 79 k D,所编码的氨基酸序列与其他已知的植物来源的PPDK基因相比,相似性大多在80%以上.在PPDK基因所编码的氨基酸序列中,发现了一个PEP利用酶位点信号,3个N-糖基化位点和15个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点和一个PEP利用酶位点.同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构.     

一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析

根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物，以水稻cDNA文库为模板，PCR扩增得到一条270bp的DNA片段，以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库，获得一条全长cDNA及其相应的全长基因，并通过测序得到了两者的全序列，该基因编码的蛋白具有GST的典型特征，在水稻中尚未见报道。     

水稻OsMDH基因的克隆及其生物信息学分析

水稻(Oryza sativa L.)OsAAP6基因是控制水稻种子蛋白质含量的主效数量性状座位(quantitative trait locus, QTL)基因,对水稻品质性状产生重要影响,而OsMDH蛋白能够与OsAAP6基因发生相互作用。利用生物信息学策略对OsMDH蛋白的理化性质、蛋白结构及功能进行预测,探究OsMDH基因的生物学功能。结果表明：水稻OsMDH基因的编码区(coding sequence, CDS)区长999 bp,编码332个氨基酸;编码蛋白为疏水蛋白且不存在信号结构,包含两个跨膜结构。通过蛋白互作分析,发现OsMDH可能与柠檬酸合酶、延胡索酸酶等发生相互作用,参与三羧酸循环过程。     

唐松草及近缘植物ITS序列和5S rRNA基因间隔区序列的分析

通过对毛茛科的唐松草(Thalicrum L.)及其近缘植物黄连、毛莨和芍药科的牡丹等植物的ITS序列和5SrRNA基因间隔区的克隆、扩增及构建系统发育树的分析研究,结果显示,唐松草扩增后ITS序列长607 bp,5SrRNA基因基因间隔区序列长323 bp;系统树证明唐松草属与黄连属和毛茛属的亲缘关系较近,结合形态学与化学等其它学科证据,本研究结论支持唐松草和黄连在进化上更接近,为含木兰花碱生物碱及毛茛甙植物的鉴别以及毛茛科相关植物的亲缘关系初步提供了分子依据.     

水稻矮秆基因d-ss的遗传分析与克隆

通过γ射线诱变,从粳稻品种9522的M2代中筛选出一株矮秆水稻(Oryza sativa L.)突变体,定名d-ss.d-ss突变体表现为叶色深绿、短宽的叶片、以及小而圆的籽粒.以d-ss突变体与籼稻品种龙特普杂交的F2代群体为基因定位群体,利用InDel分子标记将d-ss突变位点定位在5号染色体上的InDel标记ZZ5-6和ZZ1343之间,物理距离为412kb.最终通过图位克隆的方法获得了此基因,测序结果表明此基因在编码区发生了两处缺失突变.     

水稻小GTP蛋白OsRab5A的表达、纯化和GTP结合分析

小GTP结合蛋白是一类在细胞内的运输过程中重要作用的蛋白。它们通过结合子GTP而激活 ,当GTP被水解为GDP后处于非活性状态。哺乳动物中的研究表明 ,Rab5A蛋白是细胞内的形成早期内吞体 (earlyendosome)的限速因子。证实了所克隆的水稻rab5A基因编码的蛋白具有GTP结合功能。将Osrab5A基因的编码序列按正确读码框重组到pGEX4T1载体中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,电泳判定插入片段大小无误后 ,进一步测序鉴定其读码也无误。将该克隆命名为pG_5AE。以IPTG诱导 pG_5AE所编码的融合蛋白GST_OsRab5A的表达。SDS_PAGE电泳与无外源质粒和表达谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的对照相比 ,得到了预计大小的融合蛋白。以GSTrapTM亲和柱纯化融合蛋白。在不同的泳道分离纯化的融合蛋白和作为对照的含GST以及无外源蛋白的细菌总蛋白 ,电转移到硝酸纤维膜上。将该膜与α_3 2 PGTP温育 ,洗膜 ,放射自显影后 ,获得了融合蛋白结合GTP的结果 ,这表明在原核中表达出的水稻Rab5A蛋白能在体外结合GTP。     

水稻S_5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料 ,构建了一个覆盖 9倍核基因组的cosmid文库 ,其平均插入片段约4 0kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC2 3D12的R末端为探针 ,从cosmid文库中筛选得到一个阳性克隆R2I19(～ 32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱 ,初步确定为S5区候选克隆。对该克隆的 2个TAC亚克隆TRW15 10 (～ 15kb)及TRW15 17(～ 15kb)进行了初步的生物信息学分析 ,证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性 ,并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

水稻基因整合平台系统供体质粒pURKMT的构建

提高水稻产量,改良稻米品质是育种学家广泛研究的课题．随着现代生物技术的发展,水稻已成为植物基因工程的重要研究对象．许多实验室已成功地建立了一系列供外源基因转化水稻的系统．但是这些转化系统主要应用Ｔｉ质粒衍生的载体,通过Ｔ－ＤＮＡ左右两端的序列将目的基...     

水稻花粉Profilin基因启动子的克隆及序列分析

作者使用两次染色体步移（Genome walking)法，从灿稻（Oryza sativa subsp.indica)IR36中克隆到长度为569bp的花粉proiflin基因的启动子片段，并进行了全序列测定和分析。结果表明：在该段序列中含有3个TATA box，3个CAAT box和2个G－box。通过EPD（The Eukaryotic Promoter Database)的比较发现，序列的＋2－-71区域与番茄（Lycopersicon esculentum)花粉特异基因LAT52，向日葵（Helianthus annuus)花药特异基因SF2启动子关键序列的同源性为50％左右。     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

Molecular evolution of rice S 5 n and functional comparison among different sequences

The wide compatibility gene, S ₅ ⁿ , can overcome embryo sac sterility between indica and japonica subspecies of rice. Therefore, it is very important to characterize the features of the S ₅ ⁿ sequence to reveal the origin and evolution of S ₅ ⁿ . In this paper, 26 cultivated rice haplotypes and 22 wild rice accessions harboring S ₅ ⁿ were used to sequence S ₅ ⁿ . The results showed that 15 genotypes among the 48 materials were fully consistent with control cultivar 02428 (CK). The other 33 accessions had different degrees of variation in the S ₅ ⁿ sequence. Variations in the coding region mainly occurred in the second exon and eight materials showed a 10-bp deletion at 1710?C1719 bp, including wild (O. nivara) and cultivated rice, such as IRW501 and Yuetai B. S ₅ ⁿ sequences were not biased and evolved neutrally. The 48 materials could be divided into 4 categories using a phylogenetic tree of the amino acid sequences. Most of the wild rice clustered together, and the cultivated rice clustered into another group. Eight cultivated rice and O. nivara (wild rice) clustered in another group, which were found to lack 10 consecutive bases in exon 2. Eight rice varieties with high numbers of differences in their S ₅ ⁿ coding regions were crossed with testers (typically indica and japonica) to produced test cross F₁ populations. The F₁s were examined for their ability to overcome indica-japonica hybrid sterility. The result showed that the embryo sac fertility of S ₅ ⁿ -containing hybrids increased significantly compared with control hybrids, but there were no differences among the materials with divergent sequences, indirectly proving that S ₅ ⁿ is a non-functional gene.     

一个水稻抗纹枯病突变体的遗传分析及其基因的初步定位

高水平抗纹枯病突变体和高感纹枯病品种蜀恢881杂交构建分离群体,经F2分离世代的遗传分析,抗、感单株比例符合3 1(χc2=0.563,χ12,0.05=3.84),初步确定该突变体对纹枯病的抗性由一对显性主效基因所控制,命名为Rsb-2(t)。利用已合成的530对微卫星引物,对抗纹枯病突变体和蜀恢881进行多态性引物筛选,用多态性引物对上述F2分离群体的全部感病单株和部分抗病单株的DNA进行PCR分析,借助MAPERMAKER/EXP3.0软件,对其微卫星标记实验数据进行连锁分析,将Rsb-2(t)定位于第3染色体的p臂,发现RM218、RM251、RM4321和RM5748与Rsb-2(t)连锁,它们均位于着丝粒端,连锁距离分别为32.1 cM,41.1 cM,42.4 cM和49.7 cM。研究结果为进一步对该基因的精细定位奠定了基础。     

重金属镉处理的水稻幼根cDNA抑制差减杂交文库的构建

重金属污染是影响水稻生长和稻米品质的重要因素,其中又以镉(Cadmium,Cd)污染最为严重,然而目前对其分子机制以及解决措施却了解甚少。本研究以水稻品种日本晴为材料,采用0.5 mmol/L镉处理水稻幼根48 h,通过运用结合分子镜像选择(mirror orientation selection,MOS)技术的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法,构建cDNA抑制差减杂交文库,并进行microarray筛选,用于分离应答镉胁迫的差异表达基因。揭示水稻应对镉胁迫处理的分子机理,为水稻耐受镉胁迫基因的分离奠定了基础。     

水稻转录因子WRKY39的克隆表达及DNA结合活性分析

根据水稻转录因子WRKY39的cDNA基因序列设计引物,克隆水稻日本晴(Oryza sativa L.)WRKY类转录因子的cDNA基因并进行原核表达,通过凝胶阻滞实验分析融合蛋白与DNA的结合活性。结果克隆了1个新的WRKY基因OsWRKY39,其编码的蛋白OsWRKY39能够与顺式元件W盒特异结合,Os-WRKY39具有转录因子的最基本特征。