SARS病毒E基因的克隆及原核表达

为了得到纯的SARS-CoV E蛋白以进一步研究其功能,通过Touch-down PCR程序,从SARS-CoV WHU cDNA(pMD18-T载体)文库中扩增了E基因,构建了重组质粒pGEX-E,并在Ecoli DH5α中进行了原核表达。SDS/PAGE及Western blot结果表明SARS病毒E蛋白的分子量约5 kDa,较预测的略小,并进一步分析了这种现象产生的可能原因。     

日本脑炎病毒(JEV)prME的克隆及其植物表达载体构建

为研究乙脑亚单位口服疫苗,根据Genbank已发表的日本脑炎病毒（JEV）prME基因序列,设计引物,PCR扩增出5锚含有Kozak box,3端含有SEKDEL编码区的prME,克隆入pMD18-T载体中,经过序列测定后,用SnaBI和BamHI酶切消化将prME克隆入用EcoICRI和BamHI酶切消化的质粒pBI121 CaMV35S启动子和NOS终止子之间形成一个表达盒,再用HindⅢ,EcoRI酶切消化将该表达盒克隆入相同酶切的质粒pCAMBIA1301中,获得含有prME的植物双元表达载体．     

乙型肝炎病毒HBX基因的克隆、表达和蛋白的纯化

克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv1009基因的克隆、表达及亲和层析纯化

克隆表达结核分枝杆菌Rv1009基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用聚合酶链反应（PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增了Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入到pGEM—Teasv中,序列测定正确后．再亚克隆到融合表达载体pPro—EX HT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv1009蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009蛋白基因．得到融合6个组氨酸残基的Rv1009蛋白纯度大于80％。证实构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白．为以后的深入研究奠定了基础．     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1 E基因的5'端克隆及部分序列分析

根据国外报道的JEV(Japanese encephalitis virus)基因组全序列,针对JEV E基因5'端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA 为模板,经RT-PCR扩增,获得366 bp的JEV E基因cDNA片段.将此片段重组于质粒pUC 19中,并转化大肠杆菌DH5α.经PCR扩增,酶切及序列分析,结果表明JEV M73-1 5'端126个核苷酸序列与JEV日本Nakayama株和JaOArS 982株的同源性分别为96.8%和96.8%,氨基酸序列同源性均为99.2%.通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了1973年在呼和浩特市流行的脑炎是由JEV引起的流乙脑炎.E基因编码JEV的囊膜糖蛋白,是其重要表面抗原.JEV M73-1 E基因5′端克隆和部分序列分析对JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值.     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

烟草拟核小体组装蛋白cDNA的克隆、表达及其蛋白产物的纯化

从烟草BY2细胞cDNA文库中筛选到核小体组装蛋白1(Nucleosome assembly protein1,NAP1)的cDNA，序列分析发现该NAPI的cDNA编码374个氨基酸，与巳知植物来源的NAP1同源蛋白相比具有80%，以上的同源性，而且一些具有重要功能的结构域是相当保守的，如核定位信号，核输出信号，酸性结构域及异戊烯化修饰位点，重要功能结构域的存在预示了NAP1蛋白潜在多种功能，为了深入研究MAP1的功能，应用大肠杆菌表达体系高效表达了烟草NAP1蛋白，并以表达产物进行了分离纯化。     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1E基因的5′端克隆及部分序列分析

根据国外报道的 JEV( Japanese encephalitis virus)基因组全序列 ,针对 JEV E基因 5′端设计合成一对特异引物 ,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA为模板 ,经 RT-PCR扩增 ,获得 366bp的 JEV E基因 c DNA片段 .将此片段重组于质粒 p UC1 9中 ,并转化大肠杆菌DH5α.经 PCR扩增 ,酶切及序列分析 ,结果表明 JEV M73-1 5′端 1 2 6个核苷酸序列与 JEV日本 Nakayama株和 Ja OAr S982株的同源性分别为 96.8%和 96.8% ,氨基酸序列同源性均为 99.2 % .通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了 1 973年在呼和浩特市流行的脑炎是由 JEV引起的流乙脑炎 .E基因编码 JEV的囊膜糖蛋白 ,是其重要表面抗原 .JEV M73-1 E基因 5′端克隆和部分序列分析对 JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值     

羊布鲁菌外膜蛋白OMP2b的克隆，原核表达及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白 OMP2b 基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌 M5株外膜蛋白 OMP2b 蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1130bp 的目的基因片断,克隆入融合表达载体 pGEX-4T-1,构建重组质粒 pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用 Western-blot 分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了 omp2b 基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌 OMP2b 蛋白。本研究成功构建了 pGEX-4T-1-omp2b 原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的 OMP2b 蛋白具有良好的免疫原性。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

扁豆几丁质酶基因的克隆及表达

以扁豆总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增到长度为885 bp的扁豆几丁质酶基因cDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429 kDa.以该基因构建pET-21a-chi表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1 mmol.L-1IPTG,诱导5 h,表达产物的酶活力为36.25 U.mL-1.通过常压Sephadex G-50凝胶过滤色谱,DEAE-650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42 U.mg-1.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.     

日本脑炎病毒（JEV）内蒙古分离株M73—1E基因的5′端？…

根据国外报道的ＪＥＶ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）基因组全序列,针对ＪＥＶ Ｅ基因５′端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株Ｍ７３－１ＲＮＡ为模板,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,获得３６６ｂｐ的ＪＥＶ Ｅ基因ｃＤＮＡ片段。将此片段重组于质粒ｐＵＣ１９中,并转化大肠杆菌ＤＨ５α,经ＰＣＲ扩增,酶切及序列分析,结果表明ＪＥＶ Ｍ７３－１ ５′端１２６个核苷酸序列与ＪＥＶ日     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

人Sox2基因的克隆表达和纯化

应用RT-PCR方法从人胚胎十细胞中扩增出Sox2基因,构建pET28b-Sox2表达载体.用IPTG诱导转化pET28b-Sox2表达载体的大肠杆菌BL21(DE3).并优化表达条件为37℃ 1PTG0.8 mmol/L诱导4 h.以Ni-NTA亲和层析法纯化Sox2重组蛋白,对变性蛋白进行柱上和透析复性,复性后蛋白得率为0.7 mg/g湿菌重.     

重组E.coli L-天冬酰胺酶的克隆及表达与纯化

以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。     

绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。     

rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

人免疫缺陷病毒2型（HIV—2）穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ＨＩＶ－２）的原病毒基因组为模板,通过套式ＰＣＲ扩增得到了ＨＩＶ２的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,获得了重组表达质粒ｐＧＥＸ３６－ＥＮＶ．ＩＰＴＧ对重组表达菌株诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生。     

水稻黑条矮缩病毒基因组组合10编码的外壳蛋白基因的克隆及表达

从我国山东发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒，抽提病毒RNA，经RT－PCR，克隆了编码外层外壳蛋白的基因组组分10（S10）的cDNA，并进行了序列测定。与已报道的日本株和湖北等地的S10进行了序列同源性比较。结果表明，与日本株的同源性为92％，与湖北等地的同源性在97％－98％之间。将该序列构建到pGEX-3X表达载体中，经IPTG诱导，表达了分子质量约为76ku的GST融合蛋白。经亲和层析纯化和Western印迹分析，证实了该基因以可溶性的GST融合蛋白形式在原核中表达。