发夹状核酶G11 突变对体外切割活性的影响

为了研究发夹状核酶结构中G 11 特定核苷酸对于其体外切割活性的影响,用 32 P标记长度为267nt含有乙型肝炎病毒C区pKC的体外转录物作为靶RNA,把合成的G 11 位突变的发夹状核酶基因片段克隆入自剪切核酶载体p1.5内形成pHpRz;利用 32 P标记pHpRz的体外转录物,凝胶电泳进行核酶的鉴定和纯化.把未标记的各种核酶与同位素标记的靶RNA在不同条件下进行切割反应,凝胶电泳,放射自显影分析反应结果.切割结果显示与底物的靶序列完全互补的发夹状核酶具有最高的切割活性,随着与靶序列的互补能力降低发夹状核酶的切割活性逐渐下降,甚至消失.这表明发夹状核酶结构中的G 11 位点对于发夹状核酶的切割活性不是必需的,所以与发夹状核酶的G 11 位点相对应的靶序列的选择不受此位点的限制.     

低氧训练诱导骨骼肌细胞球蛋白、脑红蛋白和缺氧诱导因子-1α表达

选用健康雄性SD大鼠,应用实时荧光定量PCR法,观察不同训练条件下大鼠骨骼肌缺氧诱导因子-lα(HIF-1α)、细胞球蛋白、脑红蛋白基因表达变化.结果表明:低氧训练可增加骨骼肌HIF-lα和细胞球蛋白、脑红蛋白mRNA含量,骨骼肌组织HIF-lα表达的增加对细胞球蛋白基因表达具有促进作用.     

大鼠急性心肌缺血死亡后心肌HIF-1α、Egr-1 mRNA的表达

目的研究大鼠心肌缺血死亡后不同时间点HIF-1α及Egr-1mRNA的表达规律，为因急性心肌缺血死亡的法医学诊断提供客观依据。方法建立SD大鼠急性心肌缺血模型。随机将大鼠分为正常对照组、假手术组、急性心肌缺血试验组。采用免疫组织化学、RT—PCR死亡不同时间点大鼠心肌点HIF-1α及Egr-1mRNA的表达规律。结果大鼠心肌结扎1h缺血心肌中HIF-1α及Egr-1mRNA明显表达，随着死后时间的延长，表达降低，至术后96h仍可测到；正常对照组与假手术组均未测到HIF—1α及Egr-1mRNA表达。结论HIF—1α及Egr-1mRNA可作为诊断因急性心肌缺血死亡的敏感指标。     

人端粒酶逆转录酶核酶抑制端粒酶活性的实验研究

目的　为有效地切割端粒酶逆转录酶mRNA以降低端粒酶活性 ,从而使肿瘤细胞生长变慢 ,凋亡增加 .方法　设计并合成了 2个针对端粒酶逆转录酶mRNA的锤头状核酶基因htertRZ及htert 5’RZ ,构建了核酶基因的体外转录和真核表达质粒 ;并将核酶转染致肿瘤细胞中 ,检测其对肿瘤细胞端粒酶活性和生物学性状的影响 .结果　 2种核酶在细胞内均能明显地抑制端粒酶活性 ;核酶htertRZ稳定转染细胞后 ,使细胞生长变慢 ,倍增时间延长 ,但无明显促细胞凋亡作用 .结论　 2种核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂 ,在抑制肿瘤生长中发挥作用 .     

HIF-1α表达对人乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响

为研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在人乳腺癌细胞中的表达及其与乳腺癌细胞侵袭转移能力的相关性,采用在培养基中加入CoCl2模拟化学缺氧培养细胞,RT—PCR和Western-blot、免疫细胞化学检测HIF-1α在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA—MB-231中mRNA水平和蛋白质水平在缺氧前后的表达差异,及Millicell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测缺氧前后两株细胞侵袭迁移能力的改变．结果发现：缺氧后,两株细胞的HIF-1α mRNA水平和蛋白质水平均较缺氧前增高（p〈0．01）,MDA—MB-231和MCF-7之间有显著差异（p〈0．01）;MDA—MB-231的侵袭转移能力明显增加（p〈0．01）,MCF-7的侵袭转移能力略有增加（p〈0．05）．表明缺氧上调HIF-1α转录及蛋白表达,进而促进乳腺癌细胞的侵袭转移能力．     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆及体外转录

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株 ( PLRV-Ch)复制酶基因负链 RNA的锤头状核酶 ,设计、合成了编码与其相应的突变核酶的 c DNA,并克隆到质粒 p GEM-4 Z中 ,经序列分析及体外转录表明得到完整的突变核酶基因重组质粒 ,从而为突变核酶的转基因及进一步研究核酶在转基因马铃薯中表达引起的抗性及机理创造了条件     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变酶的克？…

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的锤头状核酶，设计、合成了编码与其相应的突变核酶的ｃＤＮＡ，并克隆到质粒ｐＧＥＭ－４Ｚ中，经序列分析及体外转录表明得到寒带的突变核酶基因重组质粒，从而为突变核酶的转基因及进上频琛麦在转基因马铃薯中表达引韦的抗性及机理创造的条件。     

局灶性脑梗死后缺氧诱导因子-1α基因的治疗作用及机制研究

目的:构建携带缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,探索HIF-1α在成年大鼠局灶性脑梗死中的治疗作用及可能机制.方法:应用腺病毒表达系统AdEasy System构建携带缺氧诱导因子-1α和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒(Ad-HIF-1α)并行PCR鉴定.建立大鼠线栓法大脑中动脉缺血再灌注模型.分为Ad-HIF-1α、腺病毒空载体(Ad)、生理盐水(NS)三组;将Ad-HIF-1α、Ad和NS分别注射到模型鼠梗死侧侧脑室.通过大体脑解剖和Nissl染色检测模型是否成功,原位杂交检测脑组织HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、SDF-1αmRNA的表达差异,三组大鼠神经功能缺失评分和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评价Ad-HIF-1α对脑缺血的治疗效果.结果:大体脑解剖标本和Nissl染色均证明大脑中动脉缺血再灌注模型成功建立.经氯化铯梯度离心法纯化后Ad-HIF-1α的滴度为8.2×108pfu/ml,PCR鉴定表明Ad-HIF-1α构建成功.三组大鼠脑梗死后HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA的表达均有明显增加,且均于72h达最高峰.Ad-HIF-1α组HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA在72h的表达与Ad和NS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而Ad和NS组比较则差异无统计学意义(P＞0.05).Ad-HIF-1α治疗组72 hAd-HIF-1α治疗组神经功能缺失评分分别为1.6±0.7和0.9±0.6,与Ad组(分别为2.9±0.6和3.2±0.6)和NS组(分别为3.0±0.7和3.2±0.8)比较差异均有统计学意义(P＜0.05).72 h时脑组织TTC染色显示Ad-HIF-1α治疗组梗死体积为81.2 mm3±1.4mm3,与Ad组(173.9 mm3±1.3mm3)和NS组(171.7mm3±6.2mm3)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:HIF-1α基因在成年大鼠局灶性脑梗死中具有积极的治疗作用,其作用机制不仅是通过上调抗缺氧基因或脑保护基因如VEGF的表达使缺氧的组织细胞保持氧稳定及耐受低氧状态,而且还通过上调修复基因如SDF-1α的表达达到修复受损的神经组织和重建神经系统的作用.     

核酶M1GS-T6对HCMV UL97基因RNA片段体外切割作用

目的:研究M1GS核酶对HCMV UL97mRNA的体外切割作用.方法:针对HCMV UL97 mRNA T6位点设计与之互补的引导序列(Guide Sequence,GS),将其共价结合至大肠杆菌核酶P催化亚基(M1 RNA)的3'末端,构建M1GS-T6核酶,并用其对UL97基因亚克隆片段转录产物进行体外靶向切割实验.结果:核酶M1GS-T6具备特异性切割靶分子UL97 mRNA的能力.结论:核酶M1GS-T6具备特异性切割活性,为进一步研究HCMV病毒基因功能和治疗提供了新的途径.     

HIF-1调控小鼠bace1基因的转录表达

阿尔茨海默症的一个关键致病原因是大脑中淀粉样蛋白（A13）的过度产生或堆积．Aβ是由其前体蛋白APP经β-和γ-分泌酶依次水解而生成的，但对于这些分泌酶基因表达的转录调控的了解还很少．由于大脑发生缺氧／缺血会造成Aβ的产量增加，而缺氧时所激活的转录因子HIF-1（Hypoxia-Inducible Factor 1）会调控下游多种基因的表达，我们对HIF-1是否参与调控β-分泌酶的表达进行了研究．对小鼠β-分泌酶基因bace1的调控序列进行分析，发现其中含有一个缺氧应答元件（Hypoxia-Responsive Element，HRE）．我们的数据显示，HRE突变片段启动报告基因荧光素酶表达的活性比正常序列片段的启动活性明显降低．电泳迁移率的变动分析（EMSA）实验进一步证实，HIF-1可以与小鼠bace1中HRE元件相互作用．当在哺乳动物细胞中过度表达HIF-1时，BACE1的mRNA水平和蛋白质水平均有明显的增高．这些结果表明小鼠bace1基因的表达受转录因子HIF-1的调控．鉴于目前阿尔茨海默症研究领域都把抑制BACE1作为首选治疗靶位，HIF-1因而有可能成为治疗AD的一种药物靶点．     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7活性的作用及影响

目的 探讨端粒酶特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性、增殖和凋亡的影响.方法 设计合成RZ基因,构建人端粒酶锤头状核酶真核表达质粒pcDNA3.1( )-hTERT-RZ,测序鉴定.提取MCF-7细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因的cDNA片段,插入载体pMD18-T并测序鉴定.将核酶重组体及hTERT载体体外转录,琼脂糖凝胶电泳检测Rz的切割活性.核酶载体转染乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR法检测核酶重组子转染效率及核酶转染细胞中hTERT mRNA的表达量,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTT法、流式细胞仪测定细胞增殖及凋亡.结果 测序表明peDNA3.1( )-hTERT-Rz和pMD18-T-hTERT构建成功.5%琼脂糖凝胶电泳表明体外转录出Rz和靶基因hTERT,Rz对靶基因hTERT具有切割活性.构建好的核酶真核表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞.发现其潜伏期延长,对数生长期减缓,S期细胞比例降低,G1期细胞比例增高(P＜0.01).端粒酶活性检测发现端粒酶活性明显降低.结论 端粒酶催化亚单位特异性核酶对靶基因hTERT在体外和体内均有催化切割活性,该核酶在乳腺癌MCF-7细胞中抑制hTERT的表达和细胞增殖,为核酶应用于恶性肿瘤的基因治疗提供了实验依据和新型工具酶.     

pEZsiRNA6.1/hHif-1α稳定转染食管鳞癌EC-9706细胞系的建立

利用基因工程技术将合成的HIF-1α shRNA与pEZsiRNA6.1空载体连接,构建pEZsiRNA6.1/hHif-1α载体,PCR和测序结果表明所构建的pEZsiRNA6.1/hHif-1α重组载体正确.进一步将所构建的载体转染人食管鳞癌EC-9706细胞系,利用G418筛选HIF-1α稳定干扰的细胞系,荧光显微镜检测结果表明：稳定转染pEZsiRNA6.1/hHif-1α的EC-9706细胞均有绿色荧光蛋白示踪.经CoCl2诱导模拟缺氧4 h,Western Blot结果显示pEZsiRNA6.1/hHif-1α能有效抑制EC-9706缺氧食管癌细胞HIF-1α的诱导表达.     

低氧与表观遗传学互作的研究进展

表观遗传学是指基因组DNA序列不发生改变的情况下,基因表达水平发生变化从而导致的可遗传表型变化的现象.表观遗传可通过与低氧诱导因子(HIF)家族协同作用,以促使细胞适应低氧环境,从而参与到低氧应答的调控过程中.现就表观遗传学通过以下四个方面与低氧应答进行综述:1)VHL与PDH3调控HIF稳定性;2)通过影响HIF-1α共激活复合物的活性、HRE位点的修饰、HIF结合位点或附近区域的染色质活性,阻止HIF与HRE位点结合;3)组蛋白脱甲基酶对低氧应答相关基因的转录调控;4)低氧环境引起细胞内整体的组蛋白修饰程度和DNA甲基化水平改变.     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制 …

设计切割烟草花叶病毒ＲＮＡ的锤头型核酶Ｒｚ－２，分别以ｐＫｙＬｘ７和ｐＢｉｎ１９为载体，构建含Ｒｚ－２基因及核酶和底物连接的ＲｚＳｂ－２基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ｔｉ质粒。     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

蜜瓜ACC氧化酶mRNA的成串锤头型核酶和反义RNA基因的合成和克隆

我们设计和合成了切割蜜瓜成熟果实ACC氧化酶mRNA的GUC^86、GUC^388、GUC^534的三重锤头型核酶（HhRz)和阻断转录的反义RNA（AR） 基因,并构建了二、四、八联体HhRz和AR基因。为了在体外和体内检测HhRz是否切割ACC氧化酶mRNA,在E.cloliDE3rna-菌株中克隆了同域和跨域作用的（HhRz)n-AR和靶子ACC氧化酶mRNA表达系统。又构建了植物体组成型和诱导型（HhRz)n-AR表达载体。     

miRNA与肿瘤发生

肿瘤发生的机制是细胞出现失控性增殖。肿瘤的发生一直被广泛认为是由于一系列癌基因蛋白和抑癌基因蛋白的开放读码框的突变而逐步形成的。随着非编码RNA（ncRNA）的发现，传统观念正被改变。最近的研究表明非编码RNA中的成员miRNA可能对于肿瘤的形成起着重要的调控作用。 miRNA（microRNA）是一类高度保守的非编码RNA（ncRNA），长度一般为19—25nt的单链型RNA（ssRNAs），由60．110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。miRNA与靶mRNA的3’UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平使基因产生沉默。越来越多的证据显示由miRNA调节的基因调控机制作为基因表达水平调控的一种重要方式，与肿瘤的发生密切相关。     

基于抗炎和促红细胞生成作用的九味补血口服液改善血虚证小鼠造血功能的机制研究

为探讨九味补血口服液改善血虚证小鼠造血功能的作用及机制,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术鉴定九味补血口服液中的化学成分;利用蛋白互作和网络分析手段筛选九味补血口服液治疗贫血的关键网络靶点,并对关键网络靶点进行基因本体(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;同时采用分子对接技术将潜在活性成分与关键网络靶点对接,评估活性分子与靶点的结合能力。在动物实验中,采用环磷酰胺建立小鼠血虚模型,设立对照组和模型组,复方阿胶浆口服液组(30 mL/kg)及九味补血口服液高、中、低剂量组(10.0、5.0、2.5 mL/kg),每天灌胃给药1次,连续32 d。检测全血中红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)水平,并利用qRT-PCR法和免疫印迹法对关键靶点及通路在血虚证小鼠肾脏的表达进行验证。结果显示,在91种鉴定的九味补血口服液化学成分中,满足口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18的条件,且具有相应靶点的潜在活性成分共计15个。分析九味补血口服液成分-血虚疾病靶点网络,获得九味补血口服液治疗贫血的关键靶点15个,主要富集于核因子-κB (NF-κB)信号通路(NF-κB signaling pathway)、代谢通路(Metabolic pathway)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll样受体信号(Toll-like receptor signaling pathway)通路等。分子对接结果显示,甘草苷、橙皮素与Toll样受体4(TLR4)具有强烈的结合能力。动物实验结果显示,与对照组相比,血虚证小鼠RBC、HGB和HCT水平明显降低,TLR4/NF-κB p65介导的炎性信号增强,缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)/促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)介导的促红细胞生成信号受抑制(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,九味补血口服液各剂量组可显著升高血虚证小鼠RBC、HGB和HCT水平,不同程度地逆转TLR4、NF-κB p65变化,并上调HIF-1α、EPO mRNA或蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01)。因此,九味补血口服液可以改善血虚证小鼠的贫血状态,其机制可能与促进肾脏中HIF-1α/EPO介导的促红细胞生成作用、减少TLR4/NF-κB p65介导的肾脏炎症反应相关。     

NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS的构建及鉴定

目的核干细胞因子(nucleostemin,NS)是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质,可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点.本文旨在构建靶向NS干扰载体p Genesil-1-NS,为后续实验奠定基础.方法基于已发布的NS mRNA序列(NM_206825),选取5'-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3'(397-416)作为候选靶序列,按shRNA载体设计原则,设计合成两条互补DNA链,退火后插入载体,并以酶切和测序鉴定重组转化子.结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体.结论成功构建NS特异性干扰载体p Genesil-1-NS,可用于NS在肿瘤中的功能研究.