中华按蚊GSTO1基因的鉴定及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是有机体内一类具有解毒和抗氧化等多功能的超家族蛋白酶。在昆虫中GST主要分为七大家族,Omega家族(GSTO)为研究较少的家族。在本研究中,通过Blast方法搜索中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组数据,得到中华按蚊GSTO1cDNA序列,全长1 059bp,其中阅读框ORF长744bp,编码248个氨基酸。推测该基因编码蛋白的分子量和等电点分别为28.5kD和6.92。分析发现该蛋白不存在跨膜区和信号肽,亚细胞定位预测显示该蛋白质位于细胞质中。同源性分析表明GSTO1蛋白与达氏按蚊(Anopheles darlingi)氨基酸序列相似性最高。本研究进一步丰富了GST蛋白的基础数据,为进一步研究昆虫GSTO蛋白的功能奠定了理论基础。     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4 008bp,编码区序列长度为1 941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(Anopheles stephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C_(3222)H_(4925)N_(875)O_(947)S_(32),为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

中华按蚊AsAce1基因的鉴定及生物信息学分析

利用同源性搜索,在中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中鉴定出1条乙酰胆碱酯酶(Ace)家族序列,命名为AsAce1(GenBank登录号:KU900233)。该基因序列的全长为5 592bp,编码区序列长度为2 253bp,编码750个氨基酸。在理化性质、二级结构、三级结构、系统发生、基因结构等方面对该基因及所编码蛋白进行了预测和分析。结果表明AsAce1蛋白在按蚊中具有很高的保守性;该蛋白是亲水性蛋白,分子量、等电点分别为82.41kD,5.92,二级结构主要以不规则卷曲为主,无跨膜结构域和信号肽;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中;基因结构为两种相位(1位和2位内含子)。研究结果为AsAce1基因生物学功能的挖掘奠定了理论基础。     

中华按蚊AsAce1基因的鉴定及生物信息学分析

利用同源性搜索,在中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中鉴定出1条乙酰胆碱酯酶(Ace)家族序列,命名为AsAce1(GenBank登录号:KU900233)。该基因序列的全长为5592bp,编码区序列长度为2253bp,编码750个氨基酸。在理化性质、二级结构、三级结构、系统发生、基因结构等方面对该基因及所编码蛋白进行了预测和分析。结果表明AsAce1蛋白在按蚊中具有很高的保守性;该蛋白是亲水性蛋白,分子量、等电点分别为82.41kD,5.92,二级结构主要以不规则卷曲为主,无跨膜结构域和信号肽;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中;基因结构为两种相位(1位和2位内含子)。研究结果为AsAce1基因生物学功能的挖掘奠定了理论基础。
     

中华按蚊AsAce2基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】对中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中的乙酰胆碱酯酶(Ace)基因进行鉴定和生物信息学分析。【方法】通过同源性搜索得到1条乙酰胆碱酯酶(Ace)基因序列,命名为AsAce2,分析了该基因的基因结构以及所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构和系统发生关系。【结果】AsAce2基因全长为4008bp,编码区序列长度为1941bp,共编码647个氨基酸;AsAce2蛋白与其他蚊虫的Ace2蛋白具有较高的同源性,在系统发育关系上与冈比亚按蚊(A-nophelesstephensi)的Ace2蛋白和不吉按蚊(Anopheles gambiae)的Ace2蛋白关系更近;AsAce2基因结构中含有3个1位和2个2位内含子;AsAce2蛋白分子式为C3222H4925N875O947S32,为亲水性蛋白,蛋白定位在细胞周质,在13~32位氨基酸为跨膜区,无疏水区和信号肽,二级结构主要以不规则卷曲为主。【结论】丰富了相关基础数据,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
     

太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44基因克隆及分子特征分析

采用RACE技术首次克隆太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44全长cDNA序列,并命名为EpCYP4C和EpCYP44。EpCYP4C基因全长序列2 032 bp,5’非翻译区60 bp,3’非翻译区487 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;EpCYP44全长cDNA序列1 752 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸,5’非翻译区85 bp,3’非翻译区182 bp。经预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白具有CYP450家族蛋白特有的血红素结合区FxxGxxxCxG;而且EpCYP4C蛋白具有CYP4家族基因特征序列EVDTFMFEGHDTT。通过多序列比对和系统进化树分析发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白与近亲真宽水蚤同源性更高,亲缘关系更近。蛋白二级结构预测显示EpCYP4C和EpCYP44蛋白主要以α螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白分布在细胞质和线粒体的可能性较大,这可能与CYP450酶系的解毒代谢机制相关。研究结果说明太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因均为CYP450酶系,且太平洋真宽水蚤EpCYP4C基因属于CYP4家族。对太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因的序列分析为进一步研究EpCYP4C和EpCYP44基因在污染物暴露下的表达奠定理论基础;同时有助于了解海洋桡足类CYP450超家族的分子特征。     

沙田柚S-RNase基因的克隆及序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到沙田柚S-RNase基因序列。该基因全长为1 238bp(GenBank登录号为KP172529),开放阅读框(ORF)全长为834bp,共编码278个氨基酸,编码的蛋白质的相对分子质量为31.402kDa,理论等电点为5.30。S-RNase蛋白为亲水性蛋白,共有17个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与柚Citrus maxima、沙糖桔Citrus reticulata和甜橙Citrus sinensis的同源性分别为99%、98%和96%。系统进化树显示沙田柚S-RNase基因与柚、沙糖桔和甜橙亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

四川黑熊ND3、ND4L和tRNA-Arg基因的克隆和序列分析

克隆并测定了四川黑熊（Ursus thibetanus mupinensis）线粒体基因组764 bp的片段,根据序列同源性比较,该DNA片段包括2个蛋白质编码基因：ND3和ND4L基因,以及1个tRNA-Arg基因.四川黑熊的ND3基因和ND4L基因的DNA序列和所编码的氨基酸序列与马来熊、棕熊、美洲黑熊和北极熊的同源性分别为：90%和95%、93%和97%、91%和96%、93%和97%;89%和98.98%、88%和98.98%、89%和100%、89%和98.98%.与棕熊、美洲黑熊和北极熊tRNA-Arg（CGA）的同源性分别为95.65%、94.20%和94.20%.拓扑结构比较显示,四川黑熊的ND3基因所编码的氨基酸序列比美洲黑熊的少了1个蛋白激酶C磷酸化位点.     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

一个紫红曲霉HR-PKS基因MpER1的克隆及序列分析

利用已知HR-PKS中ER结构域的保守氨基酸序列,通过设计简并引物,并使用本实验设计的巢式PCR方法从紫红曲霉(Monascus purpureus)中成功克隆得到一条长约300 bp的ER基因片段MpER1,再用Genome Walking的方法获得该HR-PKS中ER的基因全长序列.序列分析显示:该ER基因长为936 bp,编码312个氨基酸.将该ER基因序列与已知的ER基因序列比对,发现不同产物的ER基因同源性较差.该ER基因对应的氨基酸序列与A.clavatus 有最高的同源性,为88%.与其他物种如Nectria haematococca、Magnaporthe grisea等有50%左右的同源性.     

大熊猫核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的cDNA克隆及序列分析

为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps26基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基基因rps26的异同,以大熊猫的肌肉组织为材料,根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,成功地克隆了核糖体蛋白亚基基因rps26的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫rps26亚基基因的表达序列长为413 bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为13.025 2×103,等电点为11.61.拓扑预测显示该蛋白含有3个功能位点:1个N-糖基化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ蛄姿峄?位点和1个核糖体蛋白S26e signature位点.进一步分析发现,大熊猫rps26基因与已报道的人、西藏黄牛、野猪、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为90.23%、91.67%、92.82%、87.36%和86.78%;氨基酸序列同源性均为99.86%.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

南阳黄牛CD14基因扩增及序列分析

根据GenBank发表的荷斯坦奶牛CD14基因的序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的CD14基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含CD14完整编码区以及5’端和3’端非编码区的2 969 bp的全序列。序列分析结果表明:南阳黄牛CD14基因开放阅读框全长966 bp,共编码321个氨基酸,碱基组成分别为A(18.4%)、T(18.4%)、C(32.9%)、G(30.2%),编码区与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了2个碱基突变,没有引起氨基酸的改变。在5’端和3’端存在较长的非编码区,与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了7个碱基突变。南阳黄牛的CD14基因与荷斯坦奶牛、水牛、绵羊、山羊、猪、猕猴、大猩猩、人、小鼠的同源性依次降低,分别为99.8%、98.2%、96.8%、92.8%、83.5%、79.8%、79.7%、79.5%、71.9%。进化树所得的聚类结果与传统的分类结果一致。通过蛋白质结构预测,发现南阳黄牛CD14没有跨膜结构域。     

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

中度嗜盐菌GbsB基因的克隆、序列分析及生物信息学分析

为构建耐盐的转基因植物提供材料,根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisATCC 14580的GbsB基因的核甘酸序列设计1对特异性引物,通过PCR的方法扩增由分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsB基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,采用NCBI-BlastX软件在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:得到的GbsB基因的开放阅读框(ORF)全长为1209bp,编码1个由402个氨基酸残基组成的蛋白质;其与Bacillus licheni-formisATCC 14580的GbsB基因的氨基酸序列同源性高达96%。生物信息学分析表明:该GbsB基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个乙醇脱氢酶作用位点。     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.