不同浓度乙酸钠对耐乙酸大肠杆菌DA19蛋白质组学的影响

对耐乙酸大肠杆菌DA19在含有不同浓度乙酸钠的氮源限制基本培养基中进行了连续培养,并利用双向凝胶电泳方法分离了稳态时菌体蛋白,再利用质谱方法对表达水平存在差异的蛋白进行了鉴定.结果表明:添加外源乙酸钠使得生物素羧基载体蛋白亚基、天冬氨酸半醛脱氢酶、巯基过氧化物酶、YgiW蛋白、外膜孔蛋白OmpC和假想蛋白等表达水平增加;而50S核糖体蛋白L9、果糖1,6-二磷酸醛缩酶、ATP合成酶α亚基和结合转移蛋白Tra T表达水平减低.由此推测,生物素羧基载体蛋白亚基、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、巯基过氧化物酶、YgiW蛋白和外膜孔蛋白OmpC等与大肠杆菌DA19的乙酸耐受力提高相关.     

结核分枝杆菌新型亚单位疫苗的初步研究

为了研发结核新型亚单位疫苗,以纳米颗粒为载体展示结核分枝杆菌主要抗原ESAT6.将ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1载体上的诺如病毒P结构域的Loop2中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,用GST亲和柱纯化,并通过FPLC分析嵌合纳米颗粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠进行免疫原性的评价.结果表明:研究成功地将ESAT6基因克隆至诺如病毒P结构域的Loop2中,且空间结构模拟提示ESAT6能展示在P纳米颗粒的表面. FPLC分析表明,表达的嵌合蛋白可以高效地自我组装成纳米颗粒.用该嵌合颗粒免疫小鼠后,能诱导产生针对ESAT6重组嵌合颗粒的特异性抗体.进一步分析发现,诱导的抗体主要针对ESAT6的51～70肽段,而不是1～20肽段.综上,研究通过诺如病毒P颗粒成功地展示了结核分枝杆菌主要抗原ESAT6,为进一步研发结核新型亚单位疫苗奠定了基础.     

噬菌体展示技术筛选布鲁氏菌OMP25特异性结合肽

利用噬菌体展示技术和ELISA筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25结合的七肽分子.将纯化的OMP25-32a包被于聚乙烯板上,对随机噬菌体七肽库进行4轮筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA鉴定噬菌体克隆对OMP25-32a的亲和力和特异性.并将阳性噬菌体克隆扩增、测序、获得多肽氨基酸序列,生物信息分析筛选出特异的环形七肽分子.结果从噬菌体七肽库中筛选出42个噬菌体阳性克隆,测序翻译得到对应的42个环形七肽分子;ELISA结果表明,42个噬菌体中9#、11#、35#、38#和41#与融合蛋白OMP25-32a具有较强的亲和性;生物信息学分析42个环形七肽分子中11#环形七肽与锌指蛋白ZNF446有高度同源性.筛选获得了与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25相互作用的环形七肽分子LT-7C,为进一步研究抗布鲁氏菌病的药物治疗提供科学依据.     

OmpC高表达与大肠埃希氏菌四环素耐药的关系

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)外膜蛋白OmpC与细菌耐药关系密切,但有关其高表达与大肠埃希氏菌耐药的关系研究尚不清楚.为深入探讨OmpC的耐药功能,将ompC克隆到pET-28a载体上进行诱导表达,采用MALDI-TOF质谱分析证明,重组OmpC能够在外膜上大量表达.以此高表达菌株进行四环素耐药试验发现,ompC-pET-28a-BL21的最低抑菌浓度(MIC)值是对照菌株pET-28a-BL21的64倍.研究结果从蛋白质水平进一步证明OmpC在大肠埃希氏菌耐药中的重要作用.     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、T₄噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

展示p53蛋白表位噬菌体phage-SD的制备及应用

[目的]利用噬菌体展示技术制备一种可用于检测血清p53抗体的噬菌体.[方法]利用基因工程手段将编码p53蛋白N端20～31位的多肽SD的基因克隆到丝状噬菌体载体fADL-le的pIII蛋白基因中，制备展示该外源肽的噬菌体phage-SD并进行了Western blot鉴定.在此基础上，分别以phage-SD和重组p53蛋白为检测抗原，利用ELISA方法对乳腺癌患者血清p53抗体进行检测.[结果]成功制备出能特异性识别血清p53抗体的噬菌体phage-SD.ELISA检测结果表明，60例乳腺癌患者中phage-SD检测到13例p53抗体阳性患者，检出率为21.67%,与重组p53蛋白检测效率(21.67%)一致.[结论]成功制备一种灵敏度高、特异性强的可用于血清p53抗体检测的噬菌体phage-SD,为新型血清p53抗体检测试剂的开发及临床应用奠定基础.     

尿激酶短肽抑制剂的初步研究

以尿激酶为目标蛋白, 在噬菌体表面展示六肽库中对尿激酶的短肽类抑制剂进行了三轮特异性筛选. 提高噬菌体与尿激酶的比例及缩短作用时间从而提高筛选压力后, 与尿激酶亲和结合的噬菌体得到富集. 通过对第三轮筛选到的重组噬菌体的DNA序列分析, 获得一组相对保守的肽序列. 相应的合成短肽 NEPKAN 和VSPKVL 对尿激酶的抑制常数分别为32.5 μmol/L和88.6 μmol/L.     

人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用RT－PCR和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体（抗HBc）阳性患淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体（ScFv）基因，重组于噬菌粒载体pHEN1，转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。     

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究

研究表明,口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇.根据O/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上,构建了重组表达质粒28a-CP-VP1,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FM-DV的阳性血清,30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

VMIP—Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助助子高效表达

目的构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

变形杆菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的展示表达及重组酶的特性

在生物转化处理工业中利用细胞表面展示技术表达脂肪酶作为一种全细胞催化形式具有很大优势,因为脂肪酶展示在细胞表面作为一种固定化酶.以超折叠绿色荧光蛋白的羧基端结构域作为锚定区,构建变形杆菌来源的脂肪酶与羧基端结构域的融合基因.将融合基因插入到p ETsf GFP表达载体中,得到表面展示载体p ETsf GFP-Lip A.将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-Blue宿主菌中经自诱导后,利用免疫荧光显微技术和流式细胞仪分析确定脂肪酶成功展示于大肠杆菌细胞表面.重组酶的最高酶活达到7 009 U/g干细胞,最适反应温度和p H分别为为37℃和8.0,表面活性剂Tirton X-100、Co~(2+)和Ni~(2+)能显著提高脂肪酶的酶活,60%丙酮处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为104%,60%乙醇处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为117%,表明脂肪酶对有机试剂具有很好的耐受性.以上实验结果表明:细胞表面展示技术表达脂肪酶的最大优点为工业化应用提供了坚实的基础.     

vMIP-Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助子高效表达

目的:构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法:用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果:阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论:用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

vMIP-II肽在大肠杆菌中的双辅助子高效表达

目的 :构建病毒趋化因子 (vMIP -II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP -II重组肽 .方法 :用PCR法获得vMIP -II基因片断 ,将其插入表达载体pQE ,构建重组表达载体pEh -vMIP .表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α ,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆 .结果 :阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP -II重组肽 ,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符 (约 8× 10 3)的诱导表达条带 ,其表达量约占菌体总蛋白的 2 0 % .分析表明 ,vMIP -II重组肽主要以可溶性形式表达 .结论 :用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP -II的成功 ,为进一步研究vMIP -II的功能及应用奠定基础 ,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法     

金黄色葡萄球菌功能蛋白的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统,成功地将金黄色葡萄球菌功能蛋白ZZ锚定在酵母表面,并进一步用展示有蛋白ZZ的酵母细胞纯化出兔IgG.以pEZZ18为模板,通过PCR技术克隆了ZZ基因,将ZZ基因通过双酶切连接到穿梭载体pICAS,构建了酵母表面展示载体pICZZ,并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中.核酸电泳结果表明ZZ基因成功整合到了酵母基因组中.重组菌经培养,利用免疫荧光染色方法进行染色,显微镜观察表明ZZ蛋白已经展示在酵母细胞表面,流式细胞仪分析结果证实80.4%的酵母细胞表达了ZZ蛋白.利用展示有蛋白ZZ的酵母细胞吸附兔血清中的IgG,洗脱后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电脉,并进行W estern blot免疫印迹,结果表明,此重组酵母细胞纯化的兔IgG比标样兔IgG纯度更高.     

结核分枝杆菌RipB基因的克隆、表达及对藤黄微球菌生长的影响

提取肺结核分枝杆菌基因组DNA,PCR扩增RipB基因并将其连接到表达载体pET-21a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白.SDSPAGE表明:重组RipB表达蛋白量约占菌体总蛋白量的40％,而其在37℃表达时主要为包涵体,在15℃表达时主要在可溶上清内;Ni柱一步亲和层析获得重组RipB;100 pmol/L重组RipB可显著促进藤黄微球菌生长.