虎纹捕鸟蛛雌蛛粗毒的毛细管区带电泳分离分析

采用毛细管区带电泳（ＣａｐｉｌａｒｙＺｏｎｅＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,简称ＣＺＥ）模式,以虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ）雌蛛粗毒为样品进行电泳分离分析．对电泳缓冲溶液的ｐＨ、浓度以及有机试剂和两性离子添加剂的加入对粗毒分离的影响作了研究．结果表明,粗毒在ｐＨ１１．５,７５ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液中可以得到最佳的分离．两性离子添加剂（三甲基氨基丙磺酸）能明显改善分离效果;并在实验中确定了虎纹毒素－Ｉ（Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ－Ｉ,简称ＨＷＴＸ－Ｉ）和虎纹凝集素－Ｉ（Ｓｅ－ｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－Ｉ,简称ＳＨＬＰ－Ｉ）在粗毒电泳图谱中的位置．     

酶性DNA（Ⅱ）：蜘蛛和小牛胸腺DNA具有酯酶活性

发现虎纹捕鸟蛛和小牛胸腺ＤＮＡ具有酯酶活性，其与底物作用后最大吸收波长范围在５２０ｎｍ－５８０ｎｍ；具有一般酶促反应动力学的特点。认为ＤＮＡ酯酶活性可能与ＤＮＡ结构有关。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ天然突变体的分离纯化与鉴定

通过离子交换及反相HPLC，从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到一种虎纹毒素-Ⅰ天然突变体，MALDI-TOF质谱仪分析表明该多肽天然突变体分子量为3636 Da．Edman测序结合串联质谱和氨基酸组成分析鉴定出该天然突变体的序列为H2N-ACKGV FDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WQ-COOH，其中6个Cys形成3对二硫键，小鼠脑室注射实验表明，该天然突变体能使小鼠致死，但不能阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递，本研究结果表明，K32残基对于HWTX-Ⅰ的生物学活性有关键性作用。     

虎纹捕鸟蛛毒素HWTX -Ⅰ和芋螺毒素MVIIA嵌合体的固相化学合成

采用Fmoc固相合成的方法,将来自芋螺的ω-芋螺毒素(ω-Conotoxin) MVIIA (N-型钙离子通道阻断剂)中已知活性位点及可能的相关序列嵌入虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HWTX -Ⅰ) 的非活性位点区,代替其相应序列,构建同时携带两种活性位点的多肽嵌合体.嵌合体用 MALDI-TOF质谱鉴定.通过RP-HPLC检测其氧化复性过程,摸索出嵌合体的最佳复性条件.经过两次RP-HPLC脱盐纯化.结果表明,设计合成的嵌合体在1×10-5g/mL,利用小鼠隔神经-隔肌标本的阻断实验证明嵌合体显示了27 %的天然HWTX-Ⅰ的神经毒活性.实验结果表明,HWTX -Ⅰ具有蛋白质工程改造前景.     

虎纹捕鸟蛛毒素-IV突变体K27A-HWTX-IV的合成和复性及其生物学活性研究

用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成的方法在固相多肽合成仪上合成了用丙氨酸代替虎纹捕鸟蛛毒素—Ⅳ的第27位的赖氨酸的突变体K27A—HWTX—Ⅳ，通过反相HPLC对不同条件下突变体的氧化复性结果进行监测，摸索出其最佳氧化复性条件为：0．1mol／L Tris—HCl，pH8．0，GSH 1 mmol／L GSSG 0．1mmol／L的复性缓冲液，样品浓度为0．1mg/mL。复性产物经HPLC纯化并用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法进行鉴定，相对分子质量为4050．63Da。生物学活性实验小鼠离体膈神经—膈肌标本测活实验表明：10μg/mL天然HWTX—Ⅳ阻断小鼠离体膈神经,膈肌接头传递时间为16min，10μg/mL复性后的突变体阻断小鼠离体膈神经．膈肌接头传递时间为120min，残基的替换导致突变体生物学活性比天然毒素少，证明了第27位的赖氨酸为虎纹捕鸟蛛毒素—Ⅳ活性相关的残基。     

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.     

ω-芋螺毒素 MVIIA/虎纹捕鸟蛛毒素-I嵌合体HM-1227的合成及活性测定

用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω-芋螺毒素MVIIA和纹捕鸟蛛毒素-I的嵌合体HM-1227，经过RP-HPLC纯化和氧化复性，小鼠隔神经-隔肌标本的阻断实验显示此嵌合体能实现二硫键完全配对与稳定折叠并具有弱的神经毒活性。实验结果表明，ω-CtxMVIIA和HWTX-I的分子框架稳定，部分序列交换后仍能实现二硫键配对与折叠，说明该结构模体可以作为蛋白质工程的分子框架。     

一个与果蝇心脏基因同源的人类新基因--WNT-17基因的研究初报

利用果蝇心脏发育基因Ｗｇ的ｃＤＮＡ序列,运用计算机克隆方法,发现了一个新的人类同源基因,命名为ＷＮＴ－１７,该基因总长度为１０ｋｂ,有４个外显子和３个内含子,定位于染色体１ｐ３５．１￣１ｐ３６．２３之间。其ｍＲＮＡ全长约２ｋｂ,编码一个２９６个氨基酸的蛋白质,与小鼠Ｗｎｔ－４编码的蛋白质高度相似,该基因与Ｗｎｔ基因家族成员具有相似的同源框序列。     

天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将ｐＳＣ１０１质粒上的Ｐａｒ区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒ｐＸＺ７０上，构建成重组质粒ｐＺＺ１，将ｐＺＺ１质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养１００代后，含质粒菌数仍在９０％以上。     

虎纹捕鸟蛛（Selenocosimia huwena）粗毒对蟾蜍神经肌肉接头传递的影响

１０－５～１０－４ｇ／ｍｌ虎纹捕鸟蛛粗毒对蟾蜍坐骨神经肌肉标本有阻遏作用，１×１０－４ｇ／ｍｌ粗毒发生阻断的时间为３８ｍｉｎ，但不改变神经干动作电位，不影响肌肉对直接刺激的反应。阻断后肌肉对间接强直刺激仍可发生强直收缩；粗毒对蟾蜍坐骨神经肌肉标本的阻断作用表现为：初期４～５０秒的收缩增强继而转向抑制；粗毒可对抗箭毒的阻断作用；蟾蜍在体坐骨神经肌肉标本可被粗毒阻断，但阻断后可以恢复；粗毒不改变蛙腹直肌对Ａｃｈ的敏感性，粗毒中含有拟胆碱成份。箭毒可以阻止粗毒对蛙腹直肌的拟胆碱效应；该粗毒对蟾蜍坐骨神经肌肉标本的阻遏作用发生在神经肌肉接头，粗毒中含有拟胆碱组份，此组份可能通过后膜去极化阻断神经肌肉接头。     

日本白鲫生长激素-I基因编码区cDNA的克隆

从日本白鲫(carassius cuvieri)脑下垂体中提取总RNA，采用逆转录PCR法扩增出日本白鲫生长激素—Ⅰ cDNA编码区，克隆到Pucm-T载体上，序列测定表明日本白鲫生长激素—Ⅰ基因的开放阅读框含有630bp，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽，日本白鲫生长激素—Ⅰ基因的克隆成功为该基因的功能及应用研究奠定了基础。     

杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备

目的:克隆和表达甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multieapsid nueleopolyhedrovirus,SeMNPV) ORF29全长基因(Se29),制备SE29蛋白的多克隆抗体,方法:用PCR的方法扩增得到Se29基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌B...     

关于点变差函数的某些性质

设ｆ（ｘ）为定义于区间Ⅰ（有限或无限）上的有限实函数。任给实数δ＞０，ｘ∈０，∈Ｉ，Ｖ＾Ｘ＋δＸ－δ（ｆ）表示ｆ（ｘ）在［ｘ－δ，ｘ＋δ］上之全变差。     

动物肽类神经毒素基因工程研究进展

介绍了克隆动物肽类神经毒素cDNA和基因组基因克隆的方法,以及毒素cDNA结构和毒素蛋白前体的翻译后加工过程。概述了毒素蛋白基因组基因的结构及其mRNA前体的加工过程。综述了在毒素蛋白的基因工程方面已取得的进展,并对未来的发展前景进行了探讨。     

拟南芥胚胎发生基因LEC1对水稻胚胎发育的遗传学效应

从拟南芥的球型胚-心型胚期荚果cDNA中,通过特异引物PCR,克隆到胚胎发生调控基因LECl.将克隆的目的基因构建到植物表达载体pWM101中,将其置于35S启动子下游,并通过PCR和酶切实验验证,获得了在植物中组成型表达LECl的表达载体.提取表达载体质粒,用Nhe Ⅰ酶切质粒,使其成线型,通过花粉管通道法分别转化可育系水稻0099和不育系金23A.转基因的不育系金23A结种子,但胚乳发育缺陷,将胚乳缺陷的种子安于无激素的1/2 MS培养基中培养,其中有一株发芽,长成外观正常的植株,另一株则只长出根.提取其DNA,以特异引物P35S和P2进行检测,为阳性转基因个体.不经授粉,从不育系获得具萌发能力的种子,说明LECl基因在单子叶的农作物水稻中能促进胚胎发生.通过叶片基因组DNA特异引物PCR分子检测,证明从可育系水稻0099也获得阳性转基因植株.     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A（ChsA）的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

东北地方猪抑肌素基因表达载体的构建及其原核表达的研究

瘦肉率的提高是猪育种中重要的目标性状之一,其大小与骨骼肌的量密切相关.1997年由McPherror等发现的肌肉生长抑制素基因(myostatin,简写为MSTN)因其功能丧失后会导致小鼠骨骼肌的量极显著增加而引起广泛关注. 为进一步研究myostatin基因的本质功能,奠定猪遗传改良和分子育种基础,本研究以克隆在pGEM-3Z上的猪myostatin基因cDNA为研究对象,利用Oligo 5.0软件设计出两对上、下游特异性引物,并分别引入EcoRI和BamHI两酶切位点.扩增出与表达载体相匹配的全长与半长MSTN基因cDNA序列,构建融合表达载体,进而将构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL-21中表达出全长与半长蛋白,实现了具有二硫键基因在大肠杆菌中的正确表达.     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

利用接头插入技术构建环型T载体(pYCQ1)

人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实验室使用T载体的成本,同时增加了载体的克隆位点。利用pYCQ1作为T载体时,用XcmⅠ酶切(XcmⅠ限制性片段具有3′T末端)pYCQ1载体可以得到线性的3′T粘性末端的pYCQ1-T载体。实验验证,pYCQ1-T载体可以在受体菌E.coliDH5α中进行大量自我复制,并能够克隆1 800 bp的外源PCR产物。     

日本白鲫生长激素-Ⅱ基因编码区cDNA的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从日本白鲫脑垂体总RNA中扩增出生长激素-Ⅱ(GHⅡ)编码区cDNA，克隆到Pum-T载体上进行序列测定和分析．结果表明，克隆的cDNA的开放阅读框长度为630bp，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽．与得到的生长激素-Ⅰ(GHⅠ)的碱基序列和推测的氨基酸序列相比，同源性分别达到96．9％和98．5％．白鲫的GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已发表的金鱼GHⅠ比较，同源性分别为98．7％和100％，白鲫和金鱼的GHⅡ碱基序列和推测的氨基酸序列同源性分别为95．7％和95．2％．