细粒棘球蚴线粒体ND1基因的克隆与序列研究

为了研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,在内蒙古地区采集羊肝脏中的细粒棘球蚴,或通过手术将患者的包虫剥离囊包后采集细粒棘球蚴,提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(ND1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序.研究结果表明,细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株ND1基因序列片段长度为895bp,ND1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记.     

绵羊细粒棘球蚴Ag B基因的克隆、表达及其重组蛋白纯化

为克隆、表达绵羊细粒棘球蚴Eg Ag B基因,并纯化重组蛋白,采用PCR方法从绵羊肝脏包囊病料中扩增Ag B基因,克隆入p MD18-T载体中,测序后进行序列分析。将Ag B基因亚克隆入原核表达质粒p ET-28a中,转化入E.coli BL21感受态细胞中,用IPTG诱导Ag B蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:克隆的Ag B基因全长333 bp,通过SDS-PAGE可以检测到分子量为20 ku的特异性重组蛋白,与预期值相符;Western blot分析结果显示,该蛋白可与Eg阳性血清发生免疫学反应。本研究在大肠杆菌中成功表达的绵羊细粒棘球蚴Ag B蛋白,并证实其具有良好的反应原性,为绵羊细粒棘球蚴感染检测试剂的研发奠定了基础。     

青海省称多县野生狐狸棘球绦虫CO Ⅰ基因多态性分析

为进一步了解野生狐狸在棘球属绦虫感染传播的情况,搜集并解剖野生狐狸6只,对搜集的其中4株多房棘球绦虫、2株石渠棘球绦虫的线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶第1亚基（COⅠ）基因进行同源性分析.结果显示：6只野生狐狸中有2只感染多房棘球绦虫,感染强度分别为1640和839,1只感染石渠棘球绦虫,感染强度为833;线粒体DNA CO Ⅰ基因扩增得到了363 bp的目标片段,其中4株多房棘球绦虫与GenBank中检索到的基因序列（AB461417）一致性达到100％,2株石渠棘球绦虫的mtDNA CO Ⅰ基因序列与GenBank中检索到的基因序列（AB159136）一致性达到99.2％,有3处碱基置换位点.称多县野生狐狸肠道内寄生着棘球属绦虫,对其防控研究应该引起重视.     

十字花科部分蔬菜HRD基因的克隆与生物信息学分析

根据NCBI上得到的拟南芥HRD基因序列,利用同源序列克隆的方法,设计引物,从12种十字花科蔬菜中克隆出其核酸序列,并进行生物信息学分析,旨在验证克隆出的序列与拟南芥HRD基因是否具有同源性.对这些得到的核酸序列从DNA序列、氨基酸序列的相似性、亲/疏水性、2级结构、功能域、3级结构、同源进化树等进行了预测和较为全面的分析.结果显示经PCR扩增,都得到了大小与拟南芥HRD基因基本一致的序列,长度在555bp左右.其基因序列、氨基酸序列比对同源性分别达到93.14%和89.74%;亲/疏水性分析表明该基因编码的蛋白为亲水性蛋白;推导的氨基酸序列中均存在AP2功能结构域,属于十字花科AP2/ERF类家族转录因子基因;同源进化树分析表明它们具有很高的同源性,说明所克隆的序列与拟南芥HRD基因由同一个基因进化而来,是十字花科植物中的保守基因.     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒（NDV）ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因的分离和cDNA序列分析

为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物提供基础。通过构建的扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质结构的初步预测。结果显示:获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因DAZ基因,cDNA全长1905bp,包含1个完整的ORF,编码562个氨基酸,登录号为:GH291478。蛋白理论分子量为61.3169kD,等电点为4.77,不稳定系数50.27,脂肪系数65.04,总平均亲水性-0.472。二级结构预测该蛋白有1个跨膜区域,以无规卷曲(L)为主,没有二硫键结合位点。本研究成功分离扩展莫尼茨绦虫DAZ基因。     

阳春砂HMGR基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:克隆阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的编码区c DNA.方法:根据阳春砂叶片转录组得到的HMGR基因序列自主设计引物.用改良的CTAB法提取阳春砂叶片总RNA,反转录得到c DNA,以c DNA为模板通过PCR反应扩增阳春砂HMGR基因并克隆到p MD-18T载体,将获得的阳性克隆进行测序分析.运用生物信息学方法分析得到的c DNA序列.结果:成功扩增出全长1 716 bp的c DNA片段,将其成功克隆进入p MD-18T载体,测序后将序列提交至Gen Bank得到其编号KU572444.生物信息分析结果显示,该基因片段编码1个由571个氨基酸残基组成HMGR蛋白.HMGR二级结构主要由43.95%的α-螺旋和47.29%的β-转角组成,同时还含有8.76%的β-折叠.与其他植物该蛋白质序列同源性及进化树分析结果表明,阳春砂HMGR与小米(Setaria italic)的同源性最高,且阳春砂与单子叶植物聚为一类.结论:从阳春砂叶片中成功克隆HMGR基因并进行了生物信息学分析.     

Bacillus sp.XJ1-05菌株GbsA基因的克隆及其生物信息学分析

根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因(GeneID:3027576)的核甘酸序列设计1对特异性引物.通过PCR的方法扩增由本实验室分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsA基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,结果表明得到的GbsA基因的开放阅读框(ORF)全长为1473bp.在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:其与Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因的氨基酸序列同源性高达97%.生物信息学分析表明:该GbsA基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个醛脱氢酶作用位点.     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

扩展莫尼茨绦虫反应元件结合蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

克隆扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa）新基因,通过生物信息学方法分析该基因的生物学信息,初步预测该基因的功能,为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物,为人类的某些基因未知功能的研究提供基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克降进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;在NCBI上对该cDNA序列进行开放阅读框（ORF）的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果：获得了1个扩展莫尼茨绦虫基因－应结合蛋白,全长1861bp,编码592个氨基酸,属于DUF906家族,与曼氏血吸虫反应结合蛋白基因具有72．1％的同源性。编码蛋白的理论分子量为69．7653kDa,等电点为9．83.结论：获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,对该基因功能的初步预测,它是一种基因转录因子,在扩展莫尼茨绦虫虫体中的具体作用机制目前还不清楚,推断该基因的功能在脊椎动物,乃至人类的基因功能研究中具有一定借鉴意义.     

小鼠LEAP-2基因的克隆及其真核表达质粒的构建

从小鼠肝中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,获得了mLEAP-2基因编码区的cDNA,扩增出小鼠肝表达抗菌肽-2（mLEAP-2）成熟肽基因片段,重组入克隆载体pUCm-T,经DNA测序,该基因为120 bp,编码40个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建成表达载体pPIC9-LEAP-2。重组毕赤酵母表达载体pPIC9-LEAP-2的结构,可望获得超量表达的高活性肝表达抗菌肽-2,为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定基础。     

Burkholderia cepacia XYU-6脂肪酶的克隆及其细胞表面展示

通过分析GenBank中Burkholderia cepacia脂肪酶的序列,设计简并引物,采用同源克隆的策略,成功地从B. cepacia XYU-6菌株中克隆到脂肪酶基因bcl,其大小为1095 bp,编码364个氨基酸（ GenBank登陆号KR233260）.将bcl基因与质粒pET-28b（＋）连接并转化大肠杆菌,使脂肪酶BCL的大肠杆菌胞内过表达,其活力是野生菌的12.9倍.通过将bcl基因克隆到细胞表面展示载体pZXL中,构建脂肪酶BCL的细胞表面展示工程菌,使BCL在Lpp-OmpA引导下定位于大肠杆菌细胞表面,其活力是野生菌的3.9倍.研究结果为脂肪酶BCL后续的分子改造和应用奠定基础.     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

大麦醇溶蛋白基因片段克隆和RNAi植物表达载体构建

 为了降低啤酒大麦蛋白的含量,提高啤酒大麦品质,利用甘肃推广面积最大的品种甘啤4号为材料,克隆大麦醇溶蛋白基因保守区序列,构建RNAi表达载体。根据已知大麦醇溶蛋白基因保守序列设计一对特异性引物B2PF5′-CAACCATTTCCACAGCAACCACCAT-3′,B2PR5′-GAAAGATAGAGTAGACGATTGCACG-3′,采用PCR技术从甘啤4号大麦基因组中获得了1个349bp片段（GP4）。依据载体pHANNIBAL和pART27的结构,分别将GP4按所对应酶切位点正反向插入,利用热激法转化。结果分析显示,克隆出的片段与GenBank （NCBI）中醇溶蛋白基因核苷酸序列同源性高达92%,所构建成的RNAi表达载体pART27-pHAN-GP4中含目标片段。     

庆大霉素生物合成关键酶基因在E.coli中的克隆与表达

从庆大霉素产生菌?棘孢小单孢菌基因组中扩增出参与庆大霉素生物合成的关键酶基因——2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因GntB,将其分别克隆到克隆载体pBS-T和表达载体pET-22b(+)上,并将pET-gntB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导使GntB基因实现表达.GntB基因大小为1 193 bp,其编码的氨基酸含397个残基,约为42 kD的多肽链.     

锯缘青蟹精氨酸激酶基因的克隆与表达

通过分子生物学方法,克隆得到锯缘青蟹（Scylla serrata）精氨酸激酶（Arginine Kinase,AK）开放阅读框基因序列.测序结果显示：该开放阅读框基因的序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸残基;该序列登录Genbank（GQ：851626）,序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶与凡纳滨对虾（...     

棘球蚴抗原纯化对免疫球蛋白IgG免疫应答的影响

以纯化的棘球蚴抗原和未经纯化的粗抗原用于棘球蚴感染者血清中抗棘球蚴抗原的特异性免疫球蛋白IgG水平的检测试验,结果表明,当血清稀释度为1∶200时,使用纯化抗原可以获得较高的特异性 (98.9%),并可保持在使用粗抗原及血清稀释度为1∶400时获得的较高的敏感性（93.7%）,提示在棘球蚴感染者血清中抗棘球蚴抗原特异性免疫球蛋白IgG水平的检测中,使用纯化棘球蚴抗原和粗抗原均可获得较高的敏感性(93.7%)和较高的特异性 (98.4%,98.9%),使用纯化抗原时的特异性略高,但在统计学上并无显著差异.     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.