日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1 E基因的5'端克隆及部分序列分析

根据国外报道的JEV(Japanese encephalitis virus)基因组全序列,针对JEV E基因5'端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA 为模板,经RT-PCR扩增,获得366 bp的JEV E基因cDNA片段.将此片段重组于质粒pUC 19中,并转化大肠杆菌DH5α.经PCR扩增,酶切及序列分析,结果表明JEV M73-1 5'端126个核苷酸序列与JEV日本Nakayama株和JaOArS 982株的同源性分别为96.8%和96.8%,氨基酸序列同源性均为99.2%.通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了1973年在呼和浩特市流行的脑炎是由JEV引起的流乙脑炎.E基因编码JEV的囊膜糖蛋白,是其重要表面抗原.JEV M73-1 E基因5′端克隆和部分序列分析对JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

日本脑炎病毒（JEV）内蒙古分离株M73—1E基因的5′端？…

根据国外报道的ＪＥＶ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）基因组全序列,针对ＪＥＶ Ｅ基因５′端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株Ｍ７３－１ＲＮＡ为模板,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,获得３６６ｂｐ的ＪＥＶ Ｅ基因ｃＤＮＡ片段。将此片段重组于质粒ｐＵＣ１９中,并转化大肠杆菌ＤＨ５α,经ＰＣＲ扩增,酶切及序列分析,结果表明ＪＥＶ Ｍ７３－１ ５′端１２６个核苷酸序列与ＪＥＶ日     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP_2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50pg的病毒RNA.     

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增M基因全长,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架,通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸,将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较,病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92.3%～99.3%,编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96.0%～98.8%和92.9%～99%,分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5′调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3;′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97.65%,云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96.8%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.4%。     

鹅细小病毒C日v强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.     

牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

犬细小病毒新抗原变异株VP2基因的克隆与序列分析

目的鉴定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)新抗原变异株的病毒型,为研究CPV变异及制备CPV特异性诊断和治疗试剂奠定基础。方法从病毒细胞培养物中提取基因组DNA,设计合成针对VP2基因的1对特异引物,PCR扩增出VP2基因片段,克隆后测序,应用DNAstar进行序列分析。结果得到CPV-VP-2基因序列15份,其中CPV-2a 10份,CPV-2b 5份;FPV-VP-2基因1份。结论各序列与已发表的标准序列比较,同源性在98%以上,未形成明显分支。     

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mt coⅠ)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明coⅠ基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株coⅠ基因与其他地理株具有较高的同源性.     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板,经反转录PCR扩增,将获得ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆于pUC19中,构建成重组质粒pLR8.PCR检测和酶切检测表明,获得了ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆,从该cDNA两端进行了两次序列分析,并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较,5个序列间具高度同源性.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物, 应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段, 测序得到了该病毒F1L基因序列, 并与几个参考毒株序列进行比对. 实验结果表明, 羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低, 为96.0％, 与Jilin株同源性最高, 为99.4%. 即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小, 可作为基因工程疫苗的目的基因.     

一株野生鹧鸪源冠状病毒主要结构基因进化特性分析

从野生禽类鹧鸪的喉气管拭子中分离到1株冠状病毒，命名为Partridge/GD/S14/2003（简写为S14）.通过RT-PCR扩增、克隆测序获得了该毒株的全基因组序列（AY646283），序列经DNAstar分析发现，S14毒株与肾型毒株JX1-99，TJ2-96 S1基因同源性最高，分别达到94.6%和93.4%，并且该毒株的S1基因还和QXIBV，LX4株也存在高度亲缘性，分别达到85%和84.3%，同时对S14 S1基因BLAST时发现只有上述毒株和S14有高度同源.由此推测该鹧鸪分离株S14的进化可能与IBV肾型和腺胃型病毒存在一定关系.序列分析表明，S14毒株与GenBank中注册序列QXIBV，LX4的S2基因同源性最高分别达到97.2%和90.6%，都处于Ⅱ群.M基因系统进化树研究发现，S14处于Ⅲ群，与SAIB20，GD698同源性最高，分别达到90.6%和90.2%；而与其S1，S2基因同源较高的BJ，QXIBV株，M基因的进化关系却较远.N基因同源性和系统进化树分析发现，Ⅰ群毒株可能为H52和Gray株发生重组的结果，Ⅱ群毒株可能为H120和D1466等毒株重组的结果，而S14株处于Ⅲ群，其N基因与QXIBV高度同源，达到95.7%，Ⅳ群为肾型分离株.而与其M基因亲缘性最近的SAIB20，GD698则分处Ⅰ，Ⅳ进化群.     

八肋游仆虫一个新β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

从八肋游仆虫细胞中克隆到一种新的β-微管蛋白基因.序列分析结果表明:在大核中,该基因全长1561bp.与已经报道过的β-微管蛋白基因不同,它的5′端基因上游调控序列有49 bp,AT含量为75.5%.上游调控序列中仅有一个TATAA框,没有CCAAT框;该基因的3′端的下游调控序列有121 bp,富含AT碱基,达到86.8%,其中有明显的反向重复序列.上下游调控序列中各有一个断裂信号TTGAA和TTCAA,负责从小核到大核发育过程中大核染色体的形成.从小核基因组中克隆到相应的基因片段,比大核中的序列多7个碱基5′-CATGCTC-3′,其功能尚不清楚.序列比对表明,新的β-微管蛋白基因与已经报道的β-微管蛋白基因的同源性92.3%,阅读框中有2个氨基酸的变化,将它命名为β2-微管蛋白基因.     

猕猴肉瘤病毒SV40 T-ag-C 基因克隆及序列分析

摘要: 目的对来源于一株自然感染猕猴肉瘤病毒SV40 的猴肾细胞培养物进行大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因 克隆及核苷酸序列分析。方法采用PCR 法分别从一株自然感染SV40 病毒的猴肾细胞培养物和SV40776 标准 株接种的vero 细胞培养物提取的总DNA 中扩增出441bp 的SV40 大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因片段,分别将其 克隆到PMD18-T 载体中,转化至JM109 感受态大肠杆菌细胞后,挑取阳性克隆进行测序鉴定,并对获得的目的基 因核苷酸序列进行序列分析及同源性分析。结果来源于猴肾细胞培养物的SV40 大T 抗原片段与本实验室来源 于云南野生猴群的猕猴外周血所得到的SV40 大T 抗原片段同源性为97. 31% ,与GenBank 中登录号为NC _ 001669. 1 序列进行比对,同源性为96. 33% ; 与SV40-776 标准株接种的vero 细胞培养物所扩增的大T 抗原片段同 源性为97. 55% 。结论对大T 抗原基因克隆和序列分析是了解和掌握SV40 病毒分子流行病学及其变异趋势的 重要手段。     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

血吸虫细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的克隆与近缘种属关系分析

从生物化学的角度比较血吸虫不同虫株的遗传进化差异.以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物扩增获取血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶基因片段,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆,测序,对克隆得到的coI基因作进化分析.结果表明:无论是在核苷酸序列还是在氨基酸序列上,日本血吸虫湖北株与其近地域株(云南、江苏、湖南)均具有较高的同源性,col摹因的相似性分别为98%、98%和97%,但与不同种属血吸虫(曼氏、湄公、埃及、马来)的一致性则较低,分别为76%、84%、76%、85%,由此证实日本血吸虫湖北株与其它近地域株具有较近的亲缘关系.