HPLC法测定UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获 得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法(HPLC),测定三种蛋白的酶活力.分析使用的色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,使用的流动相是10%-100%水-甲醇或者10%-20%水-乙腈,分别使用醋酸和三氟乙酸调节了pH.使用梯度洗脱的方式对反应样品进行分析.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为：0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5酶活性及酶反应动力学分析

运用PCR扩增获得了属于尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)家族UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5的cDNA序列,构建了三种基因的GST融合表达载体,使用大肠杆菌对三种基因进行原核表达,从裂解液上清中获得具有活性的目的蛋白.分别以ABA、对氨基苯甲酸作为反应底物,通过高效液相色谱法,测定三种蛋白的酶活力.结果发现除了UGT75B1对对氨基苯甲酸表现出很高的活性以外,另外两种蛋白仅表现出了低水平的活性.三种蛋白对ABA都表现出了活性,UGT71B6具有最高的酶活力.对UGT75B1、UGT71B6、UGT71C5三种蛋白对ABA的作用进行了体外酶反应动力学分析,测定出它们的Km值分别为:0.73、0.43和0.45mM.以上结果说明UGT75B1对对氨基苯甲酸的活性明显高于ABA,对氨基苯甲酸是其专一底物.UGT71B6和UGT71C5对ABA都有较高的活性,两者Km值差距不大.     

拟南芥ABA受体与UGT71B6的相互作用研究

为进一步分析ABA尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT71B6参与植物抗逆反应的具体机制,本研究通过体外酵母双杂交实验与GST-Pull down实验、体内双分子荧光互补实验(BIFC)分析了ABA受体RCARs与UGT71B6之间的相互作用关系.实验结果显示ABA受体RCAR12、RCAR13与UGT71B6,在体内、体外均存在直接的相互作用.研究表明UGT71B6的生理功能与ABA受体之间存在重要联系, UGT71B6可能通过ABA受体的介导参与了植物逆境应答反应.实验结果也为初步探究ABA受体是否参与ABA稳态调节过程提供一定参考.     

6A,6A′-苯胺-6B,6B′-硒桥联-β-CD底物的特异性

运用双酶偶联体系分别测定6A,6A′-二苯胺-6B,6B′-二硒桥联-β-CD（6-AnSeCD）催化谷胱甘肽（GSH）还原过氧化氢（H₂O₂）、 叔丁基过氧化氢（t- BuOOH）和枯烯过氧化氢（CumOOH）3种结构不同氢过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活力, 并考察6-AnSeCD催化这3种氢过氧化物的稳态动力学. 结果表明: 6 AnSeCD还原CumOOH的GPx活力最高; 6-AnSeCD的催化机制为乒乓机制; 6 AnSeCD的假一级反应速度常数（k_max）、 米氏常数（K_m）和二级反应速率常数（k）均显示CumOOH为6-AnSeCD的最适底物.     

含不同二硫醇盐的Pt(Ⅱ)吡啶三嗪配合物的二阶NLO性质

采用量子化学DFT B3LYP/LanL2DZ+6\|31G*方法, 研究不同二硫醇盐的Pt(Ⅱ)吡啶-三嗪配合物的二阶非线性光学(NLO)性质. 结果表明： 配合物中配位原子间的距离与S=C共轭链长度密切相关; 在4种配合物中, 吡啶和三嗪部分表现出给电子特性, 二硫醇盐部分具有吸电子作用; 金属Pt(Ⅱ)可作为给电子的共轭桥, 4种配合物的偶极矩μ和极化率α成正比. NLO效应研究表明, 4种配合物均具有较大的β_tot值, 可以作为潜在的NLO材料.     

不同菌株培养顺序对添加黏土矿物白浆土腐殖质组成的影响

采用室内培养法, 以混有木质素白浆土为供试对象, 通过设置巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、 黑曲霉（Aspergillus niger）和灰色链霉菌（Streptomyces griseus）的6种培养顺序, 研究高岭石(K矿物）和蒙脱石（M矿物）对白浆土腐殖质组成的影响. 结果表明： 当以A.niger为Ⅰ期培养菌株, 或以B.megaterium为Ⅰ期、 A.niger为Ⅱ期培养菌株时, K矿物对白浆土-C(HA)-C(FA)的促进作用大于M矿物, M矿物更利于HA分子结构的复杂化, 当以S.griseus为Ⅰ期培养菌株时, M矿物更利于增加白浆土的-C(HA)C(FA); 在B.megaterium→S.griseus→A.niger培养顺序下, 与SiO₂相比, 两类矿物均有利于C(HA)C(FA)的增加; 除S.griseus→B.megaterium→A.niger外, 在其他5种培养顺序下, K矿物更利于C(Hu)的形成; 当Ⅱ期培养菌株为A.niger时, M矿物比K矿物更利于白浆土总有机碳(TOC)的矿化; S.griseus→A.niger→B.megaterium培养顺序对TOC的矿化程度最弱, 且K矿物更易促进白浆土C(WSS)的消耗, 两类矿物在A.niger→B.megaterium→S.griseus培养顺序下未对C(WSS)产生差异影响, 在其他4种培养顺序下, M矿物更易促进白浆土C(WSS)的消耗; 与SiO2相比, 两类矿物均可促进白浆土C(HE)的消耗.     

见血青总皂苷体外溶血与抗氧化活性研究

利用溶血与凝聚检查法检测见血青总皂苷体外溶血活性, 以及用DPPH自由基法、水杨酸法、邻苯三酚自氧化法研究其体外抗氧化活性.实验结果显示: 总皂苷在012~06 mg/mL范围内未表现出溶血作用, 但出现了红细胞凝聚现象; 对DPPH自由基的清除率与BHT相当, 其IC50值为017 mg/mL; 对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率较Vc弱, 且在0025~0475 mg/mL浓度范围内变化不大.     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B17抑制的研究

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)主要参与体内多种物质代谢,是人体内最重要的Ⅱ相代谢酶. UGT2B17是UGTs的一种亚型,当UGT2B17的活性被抑制,其代谢的多种内源性和外源性物质在体内蓄积,产生相应的毒副作用.本实验建立经典的体外孵育体系,采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为反应底物,测得右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B17对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为0.064 μmol/L.所以右旋甲状腺素对UGT2B17的活性有强烈的抑制作用.因此在临床中应用含右旋甲状腺素的药物时应注意其剂量,避免引起其对UGT2B17活性的抑制,导致毒副作用.     

基于序贯概率比检验的爆炸物检测系统

设计一种基于标记中子方法的爆炸物检测系统, 采用ING-27型中子发生器与硅酸钇镥闪烁晶体（LYSO）γ探测器进行探测, 并基于序贯概率比检验（SPRT）方法判别爆炸物. 通过[KG*8]对干奶粉、 硝铵(AMM)和TNT模拟物进行检测, 分析计算测量γ能谱数据中C,N,O三种元素的特征峰, 将所得概率比结果与相应的设定阈值ln A和ln B进行比较. 结果表明, SPRT方法可应用于爆炸物检测.     

通过进化模块审视拟南芥尿苷二磷酸葡糖基转移酶功能多样性

属于糖基转移酶(GTs)家族1的尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶(UGT)在转移拟南芥中的糖基的转移和糖基化次级代谢物中起重要作用.重建的系统发育树对这个多基因家族的进化关系和功能提供了新的见解和研究.通过综合分析系统发育谱和重建的系统发育树,我们系统地分析了112个拟南芥UGTs.在我们的工作中,我们检测到五个不同的进化保守模块,大多数UGTs分为同一模块,表明拟南芥UGTs在进化过程中是相当保守的.接下来收集拟南芥UGT的底物,并将它们映射到直向同源组,揭示UGT在结合特异性底物中的进化关系.通过扫描271不同物种,还预测一些未报告的蛋白质与拟南芥UGTs密切相关.     

PbF2电子和光学性质的第一性原理研究

基于密度泛函理论, 采用赝势平面波方法研究了立方萤石结构PbF2的电子和光学性质. 基态下, 晶格常数a, 体积弹性模量B0与实验值和其他理论计算值一致. 通过其能带的研究, 发现立方萤石结构PbF2是一种直接帯隙绝缘体材料, 禁带宽度为4.41eV. 密立根电荷布居数和重叠集居数显示, 电子从Pb向F转移, 电荷主要集聚在Pb F键方向, 且PbF2是一种共价键与离子键共存的化合物. 为了更进一步的研究PbF2的光学性质, 本文还计算了PbF2的介电性质、吸收系数、复折射率、能量损失谱以及反射率. 结果表明: PbF2的主要吸收光区位于紫外光区, PbF2是一种优良的紫外光学材料.     

血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的酶法制备

以扇贝裙边的酶解产物——蛋白多肽对ACE活性的抑制率作为控制水解程度的指标,确定制备ACE活性抑制肽的最佳酶种及酶解工艺技术条件.通过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味酶、枯草杆菌蛋白酶5种酶酶解扇贝裙边得到的蛋白多肽对ACE抑制能力的比较发现,5种酶在不同酶解时间所得到的酶解蛋白多肽都具有一定的ACE抑制能力,其中胃蛋白酶酶解蛋白多肽的ACE抑制率最高,为91.33%;再经L9(3)4正交实验对胃蛋白酶酶解工艺条件进行优化,确定酶解反应最佳条件是酶量400 U.g-底1物,pH 2.5,温度32℃,底物浓度(原料∶水)1∶2,酶解时间3 h;试验结果还表明,单酶(胃蛋白酶)的酶解蛋白多肽比复合酶(复合风味酶)和双酶(胃蛋白酶 木瓜蛋白酶)的酶解蛋白多肽对ACE活性的抑制能力都强.     

拟南芥糖基转移酶基因UGT71C5启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆到长度为903 bp的UGT71C5基因启动子,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,得到转基因拟南芥,并且通过启动子分析软件对全序列进行分析,发现在该段序列中含有典型的TATA-box、CAAT-box和光应答元件GT1、干旱应答元件ERD等一些顺式作用元件.利用分光光度法测定转基因植株在光照、干旱和ABA等胁迫处理下的GUS酶活力,结果表明：转基因植株的GUS酶活力介于野生型和35S阳性对照之间,与正常条件下生长的转基因植物相比,光照处理     

Star-PAP蛋白的纯化分析及其限定性因子的分离

克隆并构建了Star-PAP的表达载体,然后将该载体转染HEK293细胞,经纯化得到了重组的Star-PAP蛋白.以细胞总RNA和体外转录的U6snRNA为底物,对纯化到的Star-PAP的TUTase活性进行了分析.结果显示重组的Star-PAP能够对细胞总RNA以及U6snRNA进行体外尿苷化修饰,表明纯化到的Star-PAP具有良好的TUTase活性.此外,使用HPLC分离得到了具有U6snRNA底物特异性的细胞核组分.该组分除了含有StarPAP外,还含有一种未知蛋白,该未知蛋白可能就是赋予Star-PAP底物特异性的限定性因子.     

鲢鱼副产物蛋白质酶解条件的优化

本文以鲢鱼副产物中蛋白质为酶解底物,采用三因素二次旋转下交回归设计,研究水反应中酶-底物浓度经（[S]/[S]）PH,温度（T）三个因素对蛋白回收率的影响,得出最优水解条件为[E]/[E]=3.33%.PH=8.54.T=58C,蛋白回收率>75%.     

川丁特罗对大鼠细胞色素P450酶的影响

研究新型抗哮喘药川丁特罗（trantinterol）对大鼠细胞色素P450酶的影响. 大鼠连续7 d灌胃给予川丁特罗后, 测定肝微粒体中CYP450的质量摩
尔浓度和主要3种亚型CYP1A2,CYP2D6和CYP3A4活性的变化. 实验结果表明, 与对照组相比,  川丁特罗给药组的大鼠肝微粒体中CYP450的总质量摩尔浓度未受影响(P>0.05), 对主要亚型CYP1A2,CYP2D6和CYP3A4的活性也无影响(P>0.05), 表明该药物对肝微粒体中的主要代谢酶无抑制或诱导作用.     

结构修饰的穿心莲对UGT2B7抑制能力的评价

临床上穿心莲大多应用于治疗呼吸系统疾病、心血管系统疾病和胃肠道系统疾病等.现今,临床上多存在同时使用两种甚至两种以上的药物,引起体内代谢酶UGTs的代谢抑制,从而引发药物-药物相互作用.本实验主要研究由实验室合成的穿心莲内酯化合物A:zfx-45-7对UGT2B7酶的抑制作用,采用4-甲基伞形酮(4-MU)葡萄糖醛酸化抑制法,以4-MU作为底物对UGT2B7代谢穿心莲化合物的抑制能力做了初步的筛查,测得其残余活性小于20%,继续实验测定抑制常数K_1值为0.15μm0l/L,从而为进一步合成穿心莲药物做出理论和基础实验准备.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

短小芽孢杆菌(Bacillus p umilus )糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组 DNA 为模板,利用简并PCR 技术扩增到基因(GT‐A )全长序列.该序列全长1287 bp 、编码423个氨基酸,分子量约为49.2 KD .经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据 GT‐A 基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA‐pet28a ,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50 kD 的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

重组人源抗血管内皮生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

通过优化密码子获得带有信号肽的人源抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的重链和轻链DNA序列, 分别构建表达载体pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV, 将表达载体共转染HEK 293细胞后, 与C6胶质瘤细胞共培养, 并将所得蛋白进行分离纯化. 实验结果表明: pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV共转染HEK 293F细胞, 可显著抑制C6细胞增殖（P<0.01）; 转染24~144 h后的细胞培养上清液中均有蛋白表达; 所得纯化蛋白和标准品一致; 纯化所得抗体蛋白能明显抑制C6细胞增殖（P<005~001）, 与标准品抑制效果相似.