miR-330调控TAp73α介导的结直肠癌细胞HCT116对顺铂的敏感性

microRNA调控靶向基因的表达,影响其细胞周期进程、凋亡等过程的进行.采用双荧光素酶报告基因的方法,发现miR-330可以降低结合P73-3′UTR的荧光活性,同时在HCT116细胞中,慢病毒过表达miR-330可以抑制内源性TAp73蛋白的表达,在此基础上,用cisplatin处理细胞后,过表达miR-330的细胞加速凋亡,而这一过程在恢复TAp73的表达后,细胞凋亡活动又被减弱.另一方面,包装慢病毒shRNA-P73感染HCT116细胞所引起的生物学效应与miR-330一致.而且这种作用不依赖于p53.所以,在结肠癌细胞HCT116中,过表达miR-330可下调P73的表达并增强细胞对治疗药物顺铂的敏感性,为治疗顺铂抗性的肿瘤细胞提供了一条新途径.     

顺铂对Tca8113细胞线粒体以及内质网凋亡相关蛋白的影响

本文通过探讨顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞线粒体与内质网凋亡蛋白的影响,探讨顺铂诱导Tca8113细胞发生凋亡的机制。体外培养Tca8113细胞,顺铂(CDDP)作用后,通过MTT检测Tca8113细胞增值率;Western Blotting检测顺铂对Tca811细胞线粒体凋亡以及内质网凋亡相关蛋白表达水平的影响。与对照组相比较,CDDP可以明显抑制Tca811细胞的存活率,差异有统计学意义(P﹤0.05);Western Blotting结果显示,顺铂可以明显的增加线凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平。另外,CDDP可以增加线粒体凋亡相关蛋白Bax的表达,以及内质网凋亡相关蛋白CHOP的表达。顺铂可以诱导Tca8113细胞发生凋亡,其凋亡可能通过线粒体与内质网凋亡信号通路共同发挥作用。     

NOX4抑制剂GKT137831增强顺铂对A549细胞的毒性作用

目的:研究GKT137831(NOX4抑制剂)和顺铂单用或联用对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法:MTT法检测不同浓度的GKT137831和顺铂对细胞毒性的影响,分别选取合适的浓度进行联合用药;流式细胞法检测细胞凋亡率;酶联免疫法检测Caspase3/7活性;免疫印迹检测A549细胞中Akt、p-Akt、MRP1蛋白表达.结果:GKT137831和顺铂单用均能抑制A549细胞的增殖,并诱导其凋亡,GKT137831可增强顺铂的细胞毒性.顺铂能上调p-Akt和MRP1的表达(P0.05),GKT137831则抑制p-Akt和MRP1的表达(P0.05);与对照组和单独用药组相比,联合用药能抑制p-Akt和MRP1的表达(P0.05),表明GKT137831能抑制顺铂导致的p-Akt和MRP1表达上调.结论:GKT137831能够增强顺铂对肺癌细胞A549的毒性效应,作用机制可能通过抑制PI3K/AKT途径,调节其下游MRP1的表达有关.     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及全基因组表达谱变化研究

为了研究肥胖基因FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及基因表达谱的变化,构建小鼠FTO基因过表达慢病毒载体,包装慢病毒颗粒并感染小鼠胰岛MIN6细胞.利用QPCR和WesternBlot技术检测FTO基因在MIN6细胞中过表达情况,并检测葡萄糖刺激检测胰岛素的释放情况,进一步利用小鼠全基因芯片检测FTO过表达对小鼠胰岛MIN6细胞表达谱的影响.结果表明：慢病毒载体成功介导了FTO在MIN6细胞中过表达,FTO过表达可以显著抑制MIN6细胞的胰岛素释放.表达芯片的结果显示FTO改变MIN6细胞表达谱,发现多达922个的差异基因.FTO过表达改变了小鼠胰岛细胞的表达谱,差异基因通过一些重要信号通路影响小鼠胰岛β细胞的生物学功能.     

顺铂对卵巢癌细胞几种生长和凋亡相关基因表达的影响

顺铂是治疗卵巢癌的一线药物,它与癌细胞内的DNA结合是产生细胞毒性的主要原因.在用基因表达谱芯片筛选顺铂处理IGROV-1细胞产生的差异表达基因基础上,选取其中与细胞生长、凋亡有关的部分重要基因,用实时定量PCR方法进行了差异表达验证.结果表明,顺铂可引起CEACAM1、KLF6、JUN、TP53INP1、MAP2K4...     

南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达增强顺铂对食管癌细胞的化学敏感性并抑制裸鼠成瘤能力

摘要:目的 探究南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达对食管癌细胞化学敏感性的影响。 方法 构建食管癌肿瘤模型小鼠,使用南蛇藤醇(1、5 mg / kg)和顺铂(5 mg / kg)单独或联合对其进行瘤内治疗,观察其肿瘤体积变化和检测 30 d时肿瘤质量;免疫组化检测 Ki67,VEGF 和 Caspase 3 的表达情况。 用不同剂量的南蛇藤醇( 0. 5、1、2. 5、5、10、20、50、80、100 μmol / L)处理人食管上皮细胞系( HET-1 A) 24 h,CCK8 分析检测细胞存活率。 顺铂( 4 μg / mL) 预处理EC109 / DDP 细胞后分别用不同剂量的南蛇藤醇( 1、2. 5、5 μmol / L) 处理 EC109 / DDP 细胞,对照组用 PBS 代替顺铂,CCK8 检测细胞存活率;Transwell 检测细胞的侵袭情况,Western blot 检测细胞中 EMT 相关蛋白以及凋亡相关蛋白表达情况,Hoechst 染色检测细胞调亡情况。 结果 南蛇藤醇 1 mg / kg 和 5 mg / kg 处理后的食管癌肿瘤模型小鼠体内肿瘤质量和体积均显著降低( P< 0. 05) ;PTEN 蛋白表达水平显著升高( P< 0. 05) ;Ki67,VEGF 和 Caspase 3 阳性细胞数均显著减少( P<0. 05) 。 用南蛇藤醇(1、2. 5、5 μmol / L) 处理后,与对照组比较,EC109 细胞存活率和侵袭力均显著降低( P<0. 05) ; Ki67、PCNA、N-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达水平显著降低( P<0. 05) ;E-cadherin、cleavedPARP 和 cleaved caspase 3 蛋白表达水平以及细胞凋亡率显著升高( P< 0. 05) ;干扰 PTEN 后细胞存活率以及侵袭力显著升高( P<0. 05) ;凋亡率显著降低( P<0. 05) 。 结论 南蛇藤醇介导的 PTEN 过表达增强顺铂对食管癌细胞EC109 生长、侵袭和 EMT 的抑制作用,促进顺铂诱导的食管癌细胞 EC109 凋亡,从而增强顺铂对食管癌细胞的化学敏感性。     

ARID1A对结肠癌细胞迁移的调控作用

为研究ARID1A对结肠癌细胞迁移的影响,并进一步分析ARID1A调控细胞迁移的机制,本文通过在结肠癌细胞系HCT116中过表达和干扰ARID1A基因,观察细胞迁移率的变化,通过比较HCT116与正常组织中的基因表达数据,筛选出ARID1A共表达基因,进行GO和KEGG分析.结果显示,过表达ARID1A后,细胞迁移率降低,而干扰ARID1A则与之相反.在1212个相关系数大于0.9的ARID1A共表达基因中,仅有4个基因参与细胞增殖,29个基因参与细胞迁移,涉及趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用等多个信号通路.以上结果说明ARID1A抑制细胞迁移,并可能通过多个信号通路调控细胞迁移.     

XIAP在TRAIL抗性细胞HCT116 bax-/-中的作用机制研究

为了探索结直肠癌细胞HCT116抗TRAIL诱导凋亡的分子机制,本课题以其抗性细胞HCT116 bax~(-/-)为实验对象进行了研究.通过利用目前最热的基因定点编辑技术Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统将HCT116bax~(-/-)的XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)基因彻底敲除后,用TRAIL处理,发现其恢复了对TRAIL的敏感,形态学发生了明显凋亡,而且western blot检测显示PARP蛋白发生了完全剪切.由此证明敲除XIAP基因能克服HCT116 bax~(-/-)对TRAIL的抗性.这些发现对肿瘤细胞抗TRAIL的分子机理研究以及肿瘤的个性化治疗有非常重要的意义.     

USP13抑制溶瘤病毒诱导的肝癌细胞凋亡机制

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是一种复制能力较强且特异性识别并杀伤肿瘤细胞的禽类病毒.肝癌细胞被NDV感染后,会特异性激活肝癌细胞中的凋亡信号通路,诱导肝癌细胞发生凋亡. USP13(Ubiquitin Specific Protease 13)是去泛素化酶家族的一员,能够去泛素化和稳定PTEN分子.在Huh7和HLCZ01这两种肝癌细胞中感染NDV时,USP13的表达水平均明显降低.在NDV感染的Huh7和HLCZ01细胞中过表达USP13,细胞凋亡均明显受到抑制.反之,敲低细胞中USP13的水平,细胞凋亡明显得到增强.进一步揭示了USP13抑制NDV诱导肝癌细胞凋亡的机制,在两种肝癌细胞中过表达USP13虽然不影响细胞中NDV的复制,但发现USP13能够上调凋亡信号通路中的一个重要分子Bcl-2,进而抑制肝癌细胞的凋亡. USP13在NDV诱导的肝癌细胞凋亡中发挥着重要的作用,同时为肝癌的溶瘤病毒治疗提供了一个新的理论依据.     

泛素连接酶Nedd4调控人前列腺癌细胞的增殖与凋亡

为了研究泛素连接酶Nedd4对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,利用小RNA干扰技术,通过慢病毒包装,侵染前列腺癌细胞DU145,达到下调Nedd4表达的目的.MTT检测表明,下调Nedd4表达可以抑制DU145细胞的增殖;DAPI染色发现,下调Nedd4表达的DU145细胞对星形孢菌素诱导的细胞凋亡更加敏感.这些结果都说明,下调Nedd4的表达不仅可以抑制DU145肿瘤细胞增殖,而且可以促进细胞凋亡.     

△Np63γ和△Np63a及其C端在H1299细胞凋亡中的作用

为了研究△Np63 γ、△Np63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人△Np63γ、△Np63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-HA-Flag.通过将构建的pLVX-△Np63a、pLVX-△Np63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染人肺癌细胞株H1299后,用Western blot检测到△Np63γ、△Np63a及其C端能在H1299细胞中有效地过表达；通过PI染色以及流式细胞术检测发现△Np63a能有效挽救DNA损伤药物Cisplatin(CDDP)诱导的细胞凋亡,而△Np63γ和△Np63aCT则没有明显的挽救效果.本研究表明,在H1299细胞中,△Np63a具有抑制细胞凋亡的作用,其C端可能与其它功能域一起参与此过程.     

ΔNp63γ 和ΔNp63a及其C端在H1299细胞凋亡中的作用

为了研究ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人ΔNp63γ、ΔNp63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-HA-Flag.通过将构建的pLVX-ΔNp63a、pLVX-ΔNp63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染人肺癌细胞株H1299后,用Western blot检测到ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端能在H1299细胞中有效地过表达;通过PI染色以及流式细胞术检测发现ΔNp63a能有效挽救DNA损伤药物Cisplatin(CDDP)诱导的细胞凋亡,而ΔNp63γ和ΔNp63aCT则没有明显的挽救效果.本研究表明,在H1299细胞中,ΔNp63a具有抑制细胞凋亡的作用,其C端可能与其它功能域一起参与此过程.     

蛇葡萄素对结肠癌细胞增殖抑制、自噬诱导及自噬对增殖的影响研究

明确蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制,探讨自噬活化及自噬对AMP抑制细胞增殖作用的影响,为AMP临床研究抗肿瘤作用的自噬靶点提供依据.采用CCK-8法检测AMP(0～300μg/mL)作用HCT116细胞后细胞增殖变化,确定AMP的抗肿瘤作用;慢病毒感染法构建HCT116-R...     

肝癌患者顺铂治疗后癌细胞凋亡情况的观察

【目的】通过对肝癌患者使用顺铂治疗后,观察肝脏癌细胞凋亡情况,探讨对肝癌患者手术治疗前实施化疗的必要性.【方法】对手术切下的肝脏肿瘤组织制成细胞悬液进行荧光染色,用流式细胞仪进行细胞凋亡检测,运用统计学方法Satterthwaite近似法对这两组标本进行t检验.【结果】经顺铂治疗的病人较对照组的癌细胞细胞增殖指数显著降低,癌细胞凋亡率显著提高,而细胞增殖指数显著降低,提示诱导细胞凋亡发生是顺铂对肿瘤细胞抑制作用的主要方式.【结论】小剂量CDDP诱导治疗肝癌,作为综合治疗肝癌方法的一种是可行的,特别是在外科治疗（肿瘤切除或减低肿瘤负荷）前,作为辅助治疗能防治肿瘤的复发和转移.     

地西他滨对卵巢癌SKOV3的细胞 凋亡和增殖的影响

目的:探讨地西他滨(DAC)对人卵巢癌细胞株SKOV3的细胞凋亡和增殖等细胞生物学方面的影响.方法:采用不同浓度的地西他滨(10、100、 200 nmol/L)处理人卵巢癌细胞株SKOV3后,通过流式细胞仪检测地西他滨对人卵巢癌细胞株SKOV3的细胞凋亡的影响,细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测地西他滨、顺铂(Cisplatin)以及地西他滨联合顺铂对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖的影响.结果:浓度为100 nmol/L的地西他滨对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖抑制最明显,细胞增殖抑制率达61.31%,有统计学差异(P0.05).地西他滨浓度超过100 nmol/L后对SKOV3的抑制率没有明显升高.低浓度地西他滨联合顺铂相比于单用地西他滨或者顺铂,SKOV3的细胞增殖抑制率升高,有统计学差异(P0.05).浓度为100 nmol/L的地西他滨处理人卵巢癌细胞株SKOV3后细胞凋亡率升高,有统计学差异(P0.05).结论:低浓度地西他滨促进人卵巢癌细胞株SKOV3的凋亡,抑制SKOV3的增殖,地西他滨可能通过增强铂类化疗药物的敏感性抑制肿瘤的发生发展.     

结直肠癌细胞过表达tricellulin促进人脐静脉内皮细胞侵袭转移

三细胞间紧密连接蛋白tricellulin在结直肠癌组织中高表达,且与结直肠癌的不良预后相关。血管生成是肿瘤侵袭转移的重要因素之一,血管内皮细胞在血管新生过程中起决定作用。研究tricellulin与内皮细胞的关系对探索肿瘤侵袭转移机制具有重要意义。本研究通过western blot观察结直肠癌细胞株与正常结肠上皮细胞株中tricellulin的差异表达,通过基因工程技术调控结直肠癌细胞HCT116中tricellulin的表达,transwell小室检测过表达tricellulin前后结直肠癌细胞侵袭能力变化及其上清液对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）侵袭能力的影响,ELISA实验检测过表达tricellulin前后MMP2、MMP7的表达变化。结果显示：过表达tricellulin可增强HCT116细胞的侵袭能力,并且其上清液可增强HUVEC细胞的侵袭能力;过表达tricellulin可增加MMP2、MMP7的表达。说明人结直肠癌细胞过表达tricellulin可促进结直肠癌细胞侵袭迁移,并通过影响MMP2、MMP7的表达调控HUVEC细胞的侵袭转移。     

长非编码RNA LINC00941在结直肠癌中的表达及对细胞增殖的影响研究

为了研究与细胞分化相关的长非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA) LINC00941在肿瘤发生发展中的作用,通过实时荧光定量PCR技术检测LINC00941在6种不同类型的人类癌细胞和正常胚胎肾细胞HEK-293细胞中的表达水平,结果表明,LINC00941在结直肠癌细胞HCT116和HCT116 p53-/-、肺癌细胞A549和NCI-H1299、黑素瘤细胞Stilling中均有较高的表达水平,在结直肠癌细胞中表达水平最高. 以结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织为材料,实时荧光定量PCR检测LINC00941的表达水平发现,肿瘤组织中LINC00941 RNA的表达水平显著高于癌旁组织. 通过shRNA(short hairpin RNA)干扰技术降低HCT116细胞中的LINC00941 RNA水平,导致细胞增殖速度下降,说明LINC00941与结直肠癌的发生发展相关.