油菜转Bt基因研究

从以下几方面对油菜转Ｂｔ基因植株进行了研究：Ｒ１、Ｒ２代的Ｋｍ抗生，Ｒ０、Ｒ１代的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，Ｒ０代的抗虫试验以及Ｒ０代的酯酶活力测定。实验结果分别是：经Ｋｍ抗性试验，芥菜型油菜Ｒ１代在１２个无性系中有１０个无性系符合孟德尔单基因分离的遗传规律，Ｒ２代在７个无性系中有６个符合这一规律。     

转抗除草剂基因油菜与5种十字花科杂草的基因流研究

通过荧光显微镜和人工杂交授粉结实情况的观察，研究了抗草甘膦甘蓝型油菜Q3（Brassica. napus L.）与5种十字花科杂草的杂交亲和性.结果表明，遏蓝菜（Thlaspi arvense L.）、荠菜［Capsella bursa-pastoris （L.） Medic］、碎米荠（Cardamine hirsuta L.）、风花菜［Rorippa palustris （L.） Besser］（作母本）与Q3（作父本）杂交高度不亲和.荧光显微镜观察发现花粉管生长受阻，分别停滞在上述杂草的柱头表面或花柱上部1/3处；而野芥菜×Q3则表现出一定程度的亲和性，亲和指数为1.65.在大田邻近间隔种植和自然授粉条件下，Q3与遏蓝菜、荠菜、碎米荠和风花菜间的基因流频率为0，与野芥菜间的频率为0.86%.上述结果表明转抗除草剂基因油菜与十字花科杂草间存在不同程度的基因流，基因流频率与杂交亲和性高度相关.     

简便实用的转抗除草剂基因后代植株鉴定方法--种子萌发测定法

种子萌发法是检测外源抗性基因在转基因植物中的表达和分析外源抗性基因在转基因植物中遗传行为的简单而直接的方法,以转ｂａｒ基因燕麦后代Ｒ２种子为材料,用不同体积分数的除草剂Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ处理种子,萌发的幼苗经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｄｏｔ ｂｌｏｔ鉴定,发现在０．０３％的除草剂上萌发的幼苗,部分不含ｂａｒ基因,而在０．０７％和０．０９％的除草剂上萌发的幼苗,均含ｂａｒ基因。用０．０７％的除草剂测     

蒙导授粉条件下转抗除草剂基因油菜与4种十字花科杂草间的基因流

根据苯胺蓝荧光法观察和混合花粉蒙导授粉的结实情况,并结合授粉后代植株的分子鉴定,研究了蒙导授粉条件下甘蓝型抗草甘磷油菜Q3与遏蓝菜(Thlaspi arvense L.)、荠菜[Capsellabursa-pastoris( L.)Medic]、碎米荠(Cardamine hirsuta L.)、风花菜[Rorippa palus-tris( L.)Besser]4种十字花科野生杂草间的基因流.结果表明,当遏蓝菜、荠菜、碎米荠、风花菜分别授以混合花粉(杂草花粉与Q3花粉)蒙导后,与各自的自交组合相比,混合花粉在受体植物柱头上的萌发表现出花粉粒大量黏合、萌发快、伸进花柱与子房的花粉管数量多等特点.各蒙导组合于授粉后24-48h均可观察到一部分花粉管已经通过珠孔进入胚珠,但所有蒙导授粉后代植株抗草甘膦基因的PCR检测均表现阴性.上述研究结果进一步说明了遏蓝菜、荠菜、碎米荠、风花菜(作母本)与Q3杂交高度不亲和,Q3的抗除草剂基因不能通过基因流转移到这4种杂草中.     

表达雪花莲外源凝集素基因的油菜转基因植株的获得

利用农杆菌素LBA4404（pCAMBIA3300RG)转化优良甘蓝型油菜恢复系W723的下胚轴节段.pCAM-BIA3300RG含有Rssl启动子引导的雪花莲外源凝集素基因（gna）和CaMV-35S启动子引导的除草剂抗性基因（bar）。经过两轮除草剂（2.5mg/L bialaphos）筛选（两周/轮）,除草剂抗性再生芽被传入生根培养基中生根,对根系旺盛生长的植株中所含gna基因进行PCR分析,PCR分析证实了这些植株确为转基因植株,利用Western印迹法对随机选择的5株含gna基因的转基因植株的分析发现,其中4株表达了gna基因。目前正对这些表达gna基因的转基因植株进行后代遗传分离分析。     

转IrrE基因甘蓝型油菜对NaCl胁迫的耐受性应答

以转IrrE基因甘蓝型油菜为材料,研究了转IrrE基因甘蓝型油菜幼苗对NaCl胁迫的耐受性应答情况.在200mmol/L NaCl胁迫下,随着胁迫时间的延长,转IrrE基因和野生型油菜的POD、SOD和CAT三种抗氧化酶活性均增加,其中野生型油菜的三种抗氧化酶在24h后达到峰值,随后逐渐下降,而转IrrE基因油菜的三种...     

镉胁迫对转PprI基因油菜生理生化的影响

利用露天盆栽试验研究了不同浓度Cd胁迫下转PprI基因油菜和非转基因野生型油菜对Cd的吸收特性以及生理响应。结果表明：随着Cd胁迫浓度的升高,转基因和非转基因野生型油菜对Cd的吸收均显著增加,且二者地下部分的吸收都大于地上部分;在0.5 mg/kg Cd处理下,转基因和非转基因油菜对Cd的吸收差异不显著,但1和2 mg/kg处理下转基因油菜对Cd的吸收显著低于非转基因野生型油菜。两种油菜对Cd的富集系数和转运系数均随处理浓度的升高而降低;随着Cd浓度的增加,超氧化物歧化酶（SOD）活性呈现先上升后下降的趋势,且在相同处理浓度下,转基因油菜的SOD活性均高于非转基因野生型油菜;丙二醛（MDA）含量呈上升趋势,且其在转基因油菜中的含量均低于非转基因野生型油菜;叶绿素a和叶绿素b的含量随Cd浓度的升高而下降。因此PprI基因的导入,显著降低了油菜对Cd的吸收,提高了其可食部分安全性。     

转多个抗真菌蛋白基因水稻植株的获得及其抗稻瘟病菌的？…

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、芷蓿葡聚糖酶（β－Ｇｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（Ｂ－ＲＩＰ）基因和潮霉素基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中,获得了个潮霉素抗性再生系,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证明２－３个抗真菌蛋白基因已整合到水稻基因组中,初步抗性鉴定表明ＲＯ代转基因水稻植株对稻瘟病菌的抗生有所提高。     

PINⅡ基因通过花粉管通道法转化水稻的研究

利用花粉管通道法，用含抗除草剂基因bar及抗虫基因pin2的质粒pTW-α转化中灿HD357。经用除草剂Basta进行筛选，得到5株抗性苗。对其进行初步PCR检测，结果表明，有4株PCR结果呈阳性。用PINⅡ基因探针对其进行Southern杂交分析，有2株表现出有杂交信号，说明外源基因已整合转入到水稻基因组中。抗虫性实验尚待继续进行。     

用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究

为了寻找EPSP合酶中某些与草苷膦抗性相关的位点,利用体外定向进化技术,对可变盐单胞菌HT7的EPSP合酶基因,荧光假单胞菌G2的EPSP合酶基因以及按植物偏爱密码子合成G2的EPSP合酶基因,进行DNA shuffling,通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coil ER2799的功能互补筛选,获得了7个草苷膦抗性有较大变化的EPSP合酶突变体.     

诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸 3 磷酸合成酶(5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase,EP SPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶,植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐性.采用5′ RACE技术从诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段.序列分析结果表明:该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性.其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassicanapus)同源性最高为90%,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、烟草(Nicotianatabacum)和水稻(Oryzasativa)的同源性分别为88%,81%,64%,62%和71%.     

Cytogenetics of intergeneric hybrids between Brassica species and Orychophragmus violaceus

In the sexual intergeneric hybrids between the cultivated Brassica species and Orychophragmus violaceus, both complete separation and partial separation of the parental genomes were found to occur during mitosis and meiosis under genetic control. The cytogenetics of these hybrids was species-specific for Brassica parents. The different chromosome behavior of hybrids with three Brassica diploids ( B. campestris , B. nigra and B. oleracea ) might contribute to the different cytogenetics of hybrids with three tetraploids ( B. napus, B. juncea and B. carinata). Owing to the parental genome separation, Brassica homozygous plants and aneuploids with various chromosome constitutions were identifiable in the progenies of these hybrids, which were valuable for the study of the structure and evolution of Brassica genome and for the breeding of Brassica crops.     

从诸葛菜cDNA文库中筛选过氧化物酶基因

在200mmol／L NaCl诱导下构建诸葛菜苗期的cDNA文库，并从cDNA文库中筛选到一个新的过氧化物酶基因OvRCI，该基因cDNA全长1220bp，包含了一个1128bp的开放阅读框．通过同源分析比较及RT-PCR实验等对该基因进行了分析．结果显示该基因是一个诱导型表达的基因。     

甘蓝型油菜常规育种研究

以青油14号为母本,分别与10个优良的品种(品系)杂交,从后代筛选优良单株,获得了一些产量、抗病性比青油14号好的品系,产量增幅为8.5%~28.8%,菌核病发病率降低了29.0%~70.2%,其中14号×宽托姆达到显著水平。     

芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

作者从芸苔(Brassica campestris)中用RT-PCR方法获得了EPSPs基因的cDNA．与其他物种中的EPSPs基因进行了比对和分析发现：芸苔EPSPs基因的cDNA与欧洲油菜的同源性最高,为93％,与水稻同源性最低,仅为64％．将芸苔EPSPs的ORF片段插入到GTK融合表达载体中,为EPSPs的原核表达奠定了基础。     

甘蓝型油菜(Brassica napus)中一个未知功能蛋白基因的cDNA克隆

随着现代分子生物学的发展,许多物种,特别是拟南芥等模式生物的整个基因组序列以及其中一部分基因的功能已经比较清楚,但仍然存在大量功能未知的基因有待进一步研究,从已知片段出发,利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术钓取基因全长,并结合生物信息学技术预测蛋白质结构,是研究未知基因功能的一种重要手段．     

Cloning the Promoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of the Plant Expression Vector

The upstream regulatory region of a seed-specific gene was isolated from the genomic DNA of Brassica napus by PCR amplification. The cloned fragment contained 1755 nucleotides, and shared a sequence homology of 99.6% with the reported data. The coding region of oleic acid desaturase gene was then cloned from Arabidopsis thaliana. The sequencing analysis indicated that the sequence of the PCR product was just the same as reported before. In addition, the plant expression vector harboring the seed-specific promoter and trans-Fad2 gene was constructed.     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).     

甘蓝型油菜独脚金内酯相关基因的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新鉴定的植物激素,参与抑制茎分枝.采用同源克隆技术自甘蓝型油菜中得到了三个SLs相关基因,分别命名为BnMAX4,BnMAX1和BnD14,其CDS各长1707,1593,804bp,推测编码的蛋白质功能分别为β-类胡萝卜素加氧酶,细胞色素P450,α/β水解酶.RT-qPCR表达分析显示在野生型甘蓝型油菜二叶及四叶一心期的各组织器官中,BnMAX4主要在二叶一心期的根中表达;BnMAX1无明显表达优势组织;BnD14在二叶一心期的叶中高表达.旱胁迫及盐胁迫处理时BnMAX4的表达趋势为骤降;BnMAX1旱胁迫处理时表达量降低,盐胁迫处理时先下降后上升,9h后又下降;BnD14旱胁迫处理时在3h与12h各有两个表达高点,盐胁迫处理时在3h表达量最高.