携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用