苏云金杆菌杀虫增效作用研究进展

苏云金杆菌是一种在自然界中广泛分布的好气芽孢杆菌，由于其对昆虫的特异性毒杀作用而广泛用于农业和卫生害虫的生物防治中。但由于野外应用防效不稳定、残效期短、杀虫速度慢、对某些目标害虫不敏感，影响其作为生物杀虫剂的应用。通过特异性高毒力菌株的筛选、菌株的遗传改良、剂型的改良、各种增效剂和增效因子采用等方法，以提高苏云金杆菌制剂的杀虫活性和野外应用防治效果。本文在讨论苏云金杆菌的杀虫毒素蛋白及其作用方式的基础上，介绍了不同增效方式及其杀虫活性的影响的研究进展。     

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)感染菜青虫(Pieris rapae)幼虫的组织病理研究

本文从大体观察、显微观察和超微结构等方面对感染苏云金芽孢杆菌后的菜青虫幼虫进行了组织病理学研究。菜青虫在摄入苏云金芽孢杆菌后立即停食,30分钟后就在中肠上皮细胞中发现线粒体的脊内空间扩大、粗面内质网局部膨胀,微绒毛开始膨大并部分溶解。感染后1—2小时可见中肠上皮细胞靠近微绒毛一方出现较大的空泡,线粒体的空间进一步扩大,内质网的网膜慢慢分离。到第4小时,中肠上皮细胞的病变加剧,显微镜下看到细胞开始解体,电镜观察到线粒体开始破裂,内质网膜糊断裂。以后细胞迅速解体,到第8小时仅存基底膜,但其它组织基本完整。第10小时以后,观察到基底膜开始破裂,细菌进人血腔.脂肪体肌肉等组织均遭破坏,此时幼虫中部渐渐变黑,下痢并开始死亡。     

苏云金杆菌以色列变种防治水处理中摇蚊幼虫研究

研究了苏云金杆菌以色列变种(Bacillus thuringiensis var.israelensis de Barjac,简称B.t.i)用于摇蚊幼虫(即红虫)防治的菌种发酵条件.结果表明,发酵时间为36 h,温度为30℃,摇床转速为250 rpm,三角瓶培养基量为50 mL时,B.t.i对红虫的毒力最强.     

苏云金杆菌对主要大曲害虫的毒杀效果研究

苏云金杆菌是一种广泛应用的生物农药,苏云金杆菌在形成芽孢的同时,产生具有毒杀性的伴孢晶体.研究表明:利用液体发酵方法培养苏云金杆菌,最佳的发酵周期为2天;最佳毒杀剂量为日照条件下2.0×109个芽孢/克,非日照条件下3.2×109个芽孢/克;最佳毒杀温度为30℃,其毒杀效果在日照条件下为46%,非日照条件下为86%.     

添加剂对苏云金杆菌杀虫效果的影响

定了碱性、酸性和中性化合物及蛋白质助溶剂和芳香族化合物等 5类物质对 Bt杀虫效果影响 ,结果表明有 30种物质能促进 Bt杀小菜蛾的效果 ,其中碱性物质 11种 ,酸性物质 3种 ,中性盐 8种 ,蛋白质助溶剂5种 ,芳香族化合物 3种。在各类不同的化合物中以硼酸和 K2 CO3 对 Bt杀虫效果的促进作用较强。     

苏云金杆菌诱变筛选及杀虫效果的研究

苏云金杆菌经紫外线，硫酸二乙酯、亚硝基胍、快中子处理后，菌落小，芽孢数增加，生长周期增长，毒力增强，杀虫效果明显，在生产上有一定应用价值。     

提高苏云金芽孢杆菌制剂杀虫效果的策略

苏云金芽孢杆菌制剂是一种主要的生物杀虫剂 ,本文从培育高效菌株、增加昆虫对 Bt的摄入量、化学杀虫剂促进 Bt的杀虫作用、植物次生物质的增效作用、Bt与其杀虫微生物及其代谢产物的协同作用、简单化合物提高 Bt的毒力以及保护 Bt免受紫外光的损伤等方面提高 Bt制剂的杀虫活性进行了论述。     

苏云金芽孢杆菌cyt1Aa基因在拟步甲亚种菌株中的表达及重组菌株杀虫活性研究

将含苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,简称Bti)cyt1Aa基因的质粒电激转化至对鞘翅目害虫有专一活性的Bt拟步甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis,简称Btt)菌株中进行表达,获得重组菌株Btt-WF45。对表达产物进行SDS-PAGE分析,显示Cyt1Aa蛋白获得了大量表达。生物测定结果表明,Btt-WF45对鞘翅目小圆叶甲(Plagiodera Redtenbacher)幼虫没有毒力,对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的毒力比对照菌株4Q7-WF45高0.33倍,对白纹伊蚊(Aedes albopictus)的毒力比4Q7-WF45高0.63倍。由于在重组菌株Btt-WF45中Cry3A蛋白的表达量太低,所以在该结果中未能显示Cyt1Aa蛋白与Cry3A蛋白是否存在协同增效作用。     

苏云金杆菌δ—内毒素对离体昆虫细胞作用机制的研究

利用ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｉｓｉｓＨＤ－１δ－内毒素作用离体培养的昆虫细胞（Ｐｘ），并测定其对Ｐｘ细胞葡萄糖Ｎａ＋Ｋ＾＋离子吸收的影响，实验表明，δ－内毒素作用Ｐｘ细胞后０．５ｍｉｎ内细胞对葡萄糖的吸收大量增加，１０ｍｉｎ后，葡萄糖的吸收基本停止，细胞内Ｎａ＾＋含量的快速增加发生在δ－内毒素作用５ｍｉｎ后，Ｋ＾＋离子的含量在１ｍｉｎ后开始增加，但增加缓慢。     

Bt培养基配比及伴孢晶体纯化条件的优化

苏云金芽孢杆菌[Bt(HD-1)]发酵中培养基的配方影响发酵水平,还决定发酵产物杀虫毒力的效果.本实验在基础参数试验基础上,采用均匀设计法对Bt发酵中培养基组分、杀虫晶体蛋白纯化条件进行优化,并直接采用发酵中伴孢晶体量作为最终评价指标.结果表明:Bt培养基成分对发酵的主要影响因素依次为:MgSO4、蛋白胨、可溶性淀粉,最佳用量为(g/L):1.3、2.6、4.5;晶体蛋白双液相纯化的主要影响因素依次为:K2HPO4/KH2PO4质量比、PEG浓度、沉淀量、离心速度,最佳条件为:3:1、110 g/L、1 g、1 440 r/min,其中离心速度若选500 r/min,可能对晶体纯度提高更有利,但低速对回收率有负影响.     

苏云金杆菌发酵培养基的研究

采用正交实验法研究了不同培养基对 Bt- HD1产毒能力的影响。优选出的培养基为 :发酵液芽孢数达 5.1× 1 0 9· m L-1,2 %发酵液 2 4 h致死 3龄小菜蛾幼虫 65% ,48h 达 89% ,72 h达1 0 0 %。普通培养基对应值分别为 6.0× 1 0 8· m L-1和 35% ,83% ,1 0 0 %。优选出培养基最佳碳氮比( C/N)为 2 .0 ,最佳含固量为 8%     

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1Aa13基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物，以苏云金芽孢杆茵猝倒亚种质粒DNA为模板，应用PCR扩增技术得到一大小约为3．6kb的DNA片段(Cry1Aa13)．通过引物步行法测定该片段长3598bp，其中开放阅读框(ORF)长3540bp，编码1180个氨基酸，分子量为133．49kD，等电点pI=5．0．序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95％以上)，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，并被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13。     

荧光增白剂对苏云金杆菌制剂毒力影响的初步研究

本研究采用棉铃虫为试虫，在一定浓度的Bt溶液中加入一定浓度的荧光增白剂后，感染棉铃虫的初孵幼虫，72小时以后，对其死亡率进行统计分析，结果表明：荧光增白剂对Bt有增效作用。     

苏云金杆菌和环磷酰胺对中华稻蝗DNA的损伤

用微量注射处理法初步研究苏云金杆菌和环磷酰胺对中华稻蝗在分子水平上的毒性作用．在不同的药剂作用时间解剖虫体，取其精巢，低渗后固定保存，用传统的酚／氯仿法提取精巢总DNA(部分技术环节略作改动)电泳检测比较结果，并进行PCR随机扩增．结果显示，两种药物对中华稻蝗总DNA有明显的降解作用，苏云金杆菌处理的样品均没有随机扩增产物，环磷酰胺部分样品有随机扩增条带，但不同样品扩增条带之间的可比性较差．     

用PCR法检测苏云金杆菌的溶原性噬菌体

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t)溶原性噬菌体G IL01(GenBank Accession Number:AJ536703)的同源序列设计一对引物,用35株B.t标准菌株和生产菌株MZ1(血清型H3 a3b)的过夜培养物作模板,结果有16株菌株包括MZ1能扩增出大小约为750 bp的预期产物,推测这16株菌为溶原菌。MZ1菌株的过夜培养液与指示菌ZK1(血清型H25)混匀并在双层琼脂上培养12 h后出现了滴度为2×107pfu的噬菌斑,从而证明生产菌株MZ1确为溶原菌;又以G IL01同源性较高的其它四个基因设计引物,分别以MZ1的培养物及其溶原性噬菌体基因组为模板进行PCR扩增,结果两者得到几乎一致的带型,进一步证明了生产菌株MZ1为溶原菌,说明利用PCR法检测鉴定苏云金杆菌的溶原性是可行的。比较指示菌方法、直接电镜法和DNA鉴定法,PCR法快速简便,对B.t生产上快速检测其溶原性噬菌体有实用意义。     

苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。     

苏云金芽孢杆菌HD—1发酵工艺研究

在直径100 mm,体积4.7 L的环隙气升式内环流反应器内,考察了不同通气量及培养基含固量对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)HD-1发酵水平的影响.实验表明,在该反应器中,Bt-HD-1发酵的最佳通气量为1.75 L/min,最佳培养基含固量为3.5%.此外,通过研究通气量和培养基含固量对终止DO及终止pH的影响发现,在环隙气升式内环流反应器中,Bt-HD-1发酵的正常指标为,终止pH＞7.0,终止DO＞60%.     

Cd(Ⅱ)对多环芳烃降解菌Bacillus sp.P1产酶及酶促降解过程影响研究

为研究重金属对多环芳烃降解过程中降解菌产酶及酶促降解过程的影响,本实验以菲和Cd(II)为代表物质,探究了多环芳烃降解菌Bacillus sp.P1降解菲的过程中,不同浓度Cd(II)对Bacillus sp.P1产生的蛋白浓度、组成及降解菲程中的关键开环酶邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活以及其对菲酶促降解率的影响.结果表明,Cd(II)对Bacillus sp.P1的产酶过程和酶促降解过程均有抑制作用:当Cd(II)浓度由0mg/L增加到150mg/L时,蛋白分子条带的表达量明显减少,胞外蛋白及胞内蛋白条带总浓度分别由8.37×106,1.54×107降至5.49×106,6.01×106(Gelpro软件分析值);且当体系中Cd(II)浓度由0mg/L增加到300mg/L时,胞外和胞内酶中的邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活分别由266.96,886.30U/mg下降至38.93,290.26U/mg;且胞外酶和胞内酶对菲的酶促降解率分别由79.86%,87.96%下降至64.59%,74.83%.以上实验结果共同表明Cd(II)对降解菌Bacillus sp.P1的产酶过程及酶促降解过程的影响是其影响多环芳烃降解菌降解能力的重要机制.