谷胱甘肽合成酶的克隆与工程菌筛选

运用分子生物学方法构建含GSH基因的质粒pGEX4T-1-GSH,转化不同的宿主菌(JM109,DH5α,XBlue,BL21),挑克隆,经重组鉴定(PCR方法),IPTG诱导,检测不同菌间GSH表达产量差异,同时将同种菌部分进行非IPTG诱导对照,比较表达量差异,旨在寻找高表达GSH活性菌。结果显示,质粒pGEX4T-1-GSH重组转化JM109,DH5α,XBlue,BL21,经IPTG诱导后,GSH的产量在BL21中较高,表明BL21可以是GSH的高表达菌株。     

谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质

在成功构建了谷脱甘肽（ＧＳＨ）合成酶基因表达质料（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）的基础上,对不同大肠杆蓖突主菌进行了比较,筛选出高效、稳定表达ＧＳＨ合成酶的工程菌并进行了最佳酶表达条件的研究。结果表明：重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）表达量最高,质粒稳定性好;以５％接各量于３７℃、ｐＨ７．２培养至ＯＤ５５０＝０．５左右,加入诱导剂ＩＰＴＧ（０．ｍｍｏｌ／Ｌ）,同时切换培养条件为３４℃、ｐＨ６     

微孢子虫感染下意大利蜜蜂谷胱甘肽降解酶基因

【目的】通过生物信息学鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶2(AmCHAC2)，并通过定量PCR分析该蛋白的编码基因〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在意大利蜜蜂组织中的时空表达特征，探讨该基因在蜜蜂抵抗微孢子虫感染中的作用。【方法】采用多重序列比对分析AmCHAC2的氨基酸序列特征和结构域组成；在线预测该蛋白的结构、互作蛋白网络、细胞定位特征和功能；构建系统进化树分析该蛋白的的系统分类和进化关系；实时定量PCR分析〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在供试蜜蜂组织中的时空表达特征；采用试剂盒检测分析供试蜜蜂组织谷胱甘肽含量的表达特征；采用ELISA法检测分析供试蜜蜂中肠活性氧含量。【结果】AmCHAC2由245个氨基酸残基组成，相对分子质量为28.3 kDa，pI为6.71。AmCHAC2为疏水蛋白，不具备信号肽，定位于细胞质。供试蜜蜂在感染东方蜜蜂微孢子虫(Noseama ceranae)14 d后大量死亡，存活率仅为23%；与对照组相比，感染微孢子虫的供试蜜蜂胸部和中肠组织中〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗表达明显上调，GSH含量明显下降，且中肠内活性氧含量明显上升而触发氧化应激。【结论】〖STBX〗AmCHAC2〖STBZ〗在受到东方蜜蜂微孢子虫感染后表达上调，这可能在意大利蜜蜂抵抗微孢子虫感染过程中扮演着重要角色。     

谷胱甘肽双功能合成酶固定化研究

对谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)固定化载体进行了筛选,最终选择氧化石墨烯(GO)作为GshF的固定化载体,并对其固定化条件和固定化酶学性质进行了探讨。结果表明,固定化体系最优pH为8.0,温度为4℃,固定化时间为30 min,此时最大加载率达到90%,酶活回收率为45%。固定化体系中温度和pH的适用范围都得到了进一步提高。另外,对固定化酶的贮存稳定性和循环利用性进行了研究,结果表明在常温条件下贮存时,游离酶在第3天就几乎完全失活,而固定化酶仍保留约63%的酶活力。在重复循环利用6次后,固定化酶的酶活力仍保持在80%左右。     

固定化E.coliBL21（pTc—gsh）细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coliBL21（pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽（GSH）。从酶活收率及机械强度方面进行比较，选择卡拉胶为包埋载体，其最适PH为7.0，最适温度为40℃。相关物质对GSH的合成均有影响：半胱氨酸、甘氨酸的最达浓度为20mmol/L，谷氨酸的最适浓度为60mmol/L；Mg^2 /ATP为1-5（V/V）较合适；腺苷二磷酸（ADP）浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%。优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L，操作稳定性较好；延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%；与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24g/L，收率比直接加入ATP提高24.2%。     

乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达

以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶（L-谷氨酸：氨连接酶,Glutamine Synthetase,GSEC6.3.1.2）蛋白表达宿主菌株BL21（DE3）（pET3C／谷氨酰胺合成酶）作为研究对象,借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分别比较了最佳诱导起始生长量、所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响．实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近．本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据．     

γ—内酯合成的最新进展

总结1977～1990年间关于γ-内酯的合成工作.其合成方法分为分子内环化(羟基酸及其衍生物的分子内环化,卤代酸及其衍生物的分子内环化.不饱和羧酸及其衍生物的分子内环化,羰基酸及其衍生物的分子内环化.分子内转移、异构化),分子间环化(双键的加成,Friedel-Crafts反应,烯烃与CO_2的反应),氧化-还原反应(氧化,还原)及由内酯制内酯.     

取代 γ-丁内酯的合成

取代γ－丁内酯是一类重要香料，它们广泛地被用于烟用、食用和日用香精中。本文综述了４７篇文献，着重阐述了取代γ－丁内酯的１４种重要的实用合成方法。     

湘莲谷胱甘肽还原酶cDNA的克隆与分析

谷胱甘肽还原酶是植物体内一类重要的抗氧化酶.以湘莲叶片为材料,根据其它植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增到1个408bp大小的cDNA片段(Genbank注册号为AY781786),5`和3`RACE获得5`和3`端序列,全长1580bp,包含一个1140bp的开放阅读框架,编码380个氨基酸,与其它植物谷胱甘肽还原酶氨基酸序列的同源性在77%～92%之间.     

生物转化法重组谷氨酸脱羧酶合成γ-氨基丁酸

成功构建了一个高效表达大肠杆菌谷氨酸脱羧酶GAD来源的重组质粒pET28a-gadA,并转化E.coli BL21(DE3),工程菌株经0.4mmol/L IPTG或1g/L的乳糖, 37℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到12U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的60倍.工程菌1.15U粗酶液以31g/L L-谷氨酸钠为底物, 37℃、pH 4.0条件下反应4h,γ-氨基丁酸的生成量达到19.57g/L, L-谷氨酸钠的转化率为93%,从而为γ-氨基丁酸的生产提供了很好的前景.     

固定化酵母细胞生物合成谷胱甘肽的研究

利用酵母细胞自身ＧＳＨ合成酶和糖酵解途径再生的ＡＴＰ能够合成ＧＳＨ,在含葡萄糖０．７ｍｏｌ／Ｌ,硫酸镁１０ｍｍｏｌ／Ｌ,０．３ｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液和谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸各２０ｍｍｏｌ／Ｌ的１０ｍＬ反应液中,加入１０ｇ（湿重）固定化酵母细胞,３０℃振荡反应８ｈ产生０．９１ｇ／Ｌ的ＧＳＨ。加入腺苷会降低ＧＳＨ的产量;当腺苷开始转化生成ＡＴＰ时加入前体,可明显提高ＧＳＨ的产量。实验结果初步表明：Ａ     

利用重组大肠杆菌生产聚-3-羟基丁酸的研究

利用携带能合成聚-3-羟基丁酸的基因的大肠杆菌E. coli XL1-Blue,优化培养基和培养条件后,进行了补料分批培养.结果表明,重组大肠杆菌E. coli XL1-Blue(pKSS105)的最适培养基为R培养基.在最佳条件下,以葡萄糖为唯一碳源培养工程菌60h后,发酵液中菌体干重达183g/ L,P(3HB)的产量为133.8g/ L,P(3HB)含量为73.1%.实验结果为P(3HB)实际应用提供了可能性的基础.     

利用大肠杆菌工程菌生产2,3-二磷酸甘油酸的研究

通过基因工程的方法,将表达人源BPGM(bisphosphoglycerate mutase二磷酸甘油酸变位酶,E.C.2.7.5.4.)的质粒转化入大肠杆菌内,并进行培养条件的优化摸索,通过向培养基内加入葡萄糖使大肠杆菌大量发酵生产2,3-BPG(2,3-bisphosphoglycerate,2,3-二磷酸甘油酸).结果表明,当培养基中葡萄糖质量浓度为10 g/L,诱导时间为4 h,大肠杆菌工程菌表达的2,3-BPG含量最高.如果诱导后加入终质量分数为0.5%的Tween 80可以有效促进2,3-BPG分泌到培养基中.诱导后4 h添加新培养基,补加葡萄糖可以使2,3-BPG的产量提高1倍,达到7.5 mmol/L.     

工程菌在无机培养基中共培养生产聚羟基烷酸的研究

本研究主要是利用工程菌E.coli XL1-Blue(pKY105)和工程菌E.coli XL1-Blue(pKSSE5.3)以葡萄糖为唯一碳源进行共培养,生产了共聚物(P(3HB-co-4HB)),结果表明,两种工程菌共培养能够获得塑性更强的PHA.     

植酸酶工程菌产酶条件优化研究

为研究影响植酸酶酵母工程菌的产酶因素,利用摇瓶发酵对毕赤酵母工程菌产植酸酶的最佳甲醇诱导量、诱导时间等因素进行实验分析。结果显示,残留甘油、甲醇浓度、诱导培养时间对植酸酶生产具有重要影响,其中甘油残留会使植酸酶分泌时间延迟,1.5% 甲醇具有最佳诱导效果,在第2天酶活可以达到约1 100 U/mL,低浓度甲醇诱导产酶缓慢积累,而高浓度甲醇对菌体产生毒害。该研究为进一步优化植酸酶工程菌高密度发酵工艺奠定了基础。     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

人工地震采油工艺技术的研究与应用

人工地震采油是通过地面可调频振源进行一定频率的振动,产生振动波,在油层发生一系列的波动效应,达到增产增注目的的一项物理法采油技术。主要对该技术的增油机理以及在辽河油田兴隆台采油厂的现场应用情况进行了评价,得出了结论。     

发酵法生产右旋糖酐的工艺研究

文章对由肠膜状明串珠菌L.M-0326(Leuconostocmesenteriodes)发酵生产右旋糖酐的工艺过程及条件进行了探讨,通过对其发酵过程中的粘度、pH值、果糖、右旋糖酐生成和分子量变化的研究及对发酵诱导物的考察,得到了右旋糖酐发酵工艺的相关工程曲线。结果表明:通过定向发酵技术可得到符合要求的不同分子量的右旋糖酐,避免了老工艺中酸水解工艺;控制发酵培养基pH值为8.0,可使产率最大;无机盐离子Mn2+和Ca2+能促进L.M菌的生长,其促进菌生长的程度大小依次为:Mn2++Ca2+>Mn2+>Ca2+。     

谷胱甘肽对Cd的解毒机理研究

用原子力显微镜研究还原型谷胱甘肽（GSH）对重金属离子Cd的解毒过程,谷胱甘肽和Cd能迅速形成络合物,此络合物有多个活性点,在汞表面能够迅速生长,在开始的1 min的时间内,谷胱甘肽和Cd的络合物是以平均高度为0.574 nm的单分子层吸附在汞的表面,少量形成底面直径达160 nm,高度达46 nm的组装团。随后2 min,端基是活性组装点,整体以向空间垂直方向组装的模式生长。随后侧基的活性显现,侧基的组装和端基的组装同时进行,GSH-Cd不但向垂直方向长高,还向平面方向铺展,形成厚度达18 nm的铺展层和在铺展层上直径为527 nm,高度为80 nm的大分子组装峰。时间达8 min时,各种分子的作用趋于稳定。重金属离子与谷胱甘肽的多个活性基团作用,轻松实现解毒作用。     

黑木耳菌糠基质下毛木耳细胞工程菌株的生殖生长

以毛木耳［Auricularia polytricha(Mont.)Sacc］细胞工程菌株新河大SL205为供试菌株,以黑木耳菌糠为主要生殖生长基料,以菌丝长速、生殖生长生物学效率为指标,设计不同培养基配方进行实验.结果表明:供试菌株新河大SL205的适宜培养基配方为黑木耳菌糠50%(质量分数,下同)、木屑30%、玉米芯10%、麸皮8%、石灰2%;该培养基下,新河大SL205平均长速为7.26 mm/d,生物学效率为126.29%,对黑木耳菌糠生物降解能力最强,有效降低了黑木耳菌糠带来的面源污染.