拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位

离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节,亦是植物在组织和器官水平上进行养分吸收运移的基础．在植物中镍（Ni）元素主要以Ni^2＋的形式存在,并通过Ni^2＋转运蛋白将其跨膜转运至相应的组织器官,参与氢酶和脲酶的合成．生物信息学分析表明,拟南芥中一个Ni^2＋转运蛋白AT2G16800含有叶绿体定位信息．克隆该基因5’端编码转运肽的272bp片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后,在拟南芥中高效表达,对其进行了亚细胞定位的研究．转基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP荧光信号只存在于叶绿体中,该结果表明A他G16800为叶绿体蛋白．     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

人参亲环素基因表达载体构建及其在拟南芥中的抗盐活性分析

摘 要 为研究人参亲还素基因的抗盐活性,为该基因在人参抗逆育种方面的应用提供参考,通过植物转基因技术和外施不同浓度NaCl的方法获得阳性拟南芥植株,研究了不同植株类型不同盐浓度下的种子萌发率、植株生存率、植株主根长、植株分支数等相关指标。结果表明：在盐胁迫作用下转基因拟南芥种子萌发率高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株生存率显著高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株主根长大于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株分支数与野生型拟南芥植株分支数没有明显差异。可见人参亲还素基因提高了转基因拟南芥抵御高盐胁迫的能力。     

盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一,PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运.本文以盐芥幼苗根cDNA为材料,克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因.生物信息学分析结果表明,ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基,蛋白分子质量为58.1,ku,等电点6.33,是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白,含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构.实时定量PCR结果显示,低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达,而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同.ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明,不同浓度低磷胁迫处理下,与野生型拟南芥相比,35S:ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低,叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高,花青素含量降低.上述结果表明,盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答,能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力,为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因.     

转蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中,构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中,PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株,RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明,干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照,叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明,转基因烟草植株积累果聚糖,并在干旱胁迫后含量明显增加,而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半;在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制,而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明,转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

拟南芥AtSuc3和AtSuc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用。为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3、At-Suc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础。     

假俭草EoNLA基因克隆与其转基因拟南芥在不同磷水平下的表型鉴定

【目的】磷元素是植物必需的大量营养元素,在植物的生长发育中必不可少。NLA(nitrogen limitation adaptation)蛋白是一种RING型E3泛素连接酶,参与磷转运蛋白的泛素化调控,在植物体的磷素平衡调节方面发挥重要作用。以假俭草这类天然适应低磷土壤条件的植物为研究材料,通过研究假俭草EoNLA的磷高效转运分子机制,为草坪草适应酸性土壤生境的磷高效转运分子育种和栽培调控提供理论依据。【方法】通过RACE方法克隆获得EoNLA基因,应用生物信息学分析确定基因的全长序列及编码氨基酸序列,采用原生质体瞬时表达体系确定EoNLA蛋白膜定位;通过qRT-PCR方法分析EoNLA基因低磷诱导下的表达模式,并通过农杆菌介导转化拟南芥进行基因功能鉴定。【结果】EoNLA基因序列全长1 353 bp,编码一个长度为331个氨基酸的蛋白。该蛋白具有NLA蛋白典型的RING结构域和SPX结构域,EoNLA蛋白定位于细胞膜,EoNLA基因在根组织的表达量显著高于在茎和叶的表达。【结论】EoNLA基因具有根组织表达特异性,且基于拟南芥转基因植株进行的功能鉴定,进一步显示EoNLA基因具有磷素调控相关的功能。     

拟南芥糖基转移酶基因UGT71C5启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆到长度为903 bp的UGT71C5基因启动子,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,得到转基因拟南芥,并且通过启动子分析软件对全序列进行分析,发现在该段序列中含有典型的TATA-box、CAAT-box和光应答元件GT1、干旱应答元件ERD等一些顺式作用元件.利用分光光度法测定转基因植株在光照、干旱和ABA等胁迫处理下的GUS酶活力,结果表明：转基因植株的GUS酶活力介于野生型和35S阳性对照之间,与正常条件下生长的转基因植物相比,光照处理     

作物叶中蔗糖磷酸合成酶的生物学功能与调控的研究进展

介绍转蔗糖磷酸合成酶(SPS)的基本理化特性及SPS基因的克隆情况,综述利用转基因SPS植株研究作物叶中的SPS对光合作用产物的分配积累以及对作物的生长、发育、产量、品质、氮素转运的影响,以及SPS对高浓度二氧化碳的反应和SPS活性的调控等方面的研究进展.提出今后SPS的研究重点应该围绕解析SPS和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)之间的关系,以及选育用于生产生物质能源的转SPS基因的甘蔗和木薯品种等方面开展.     

豌豆根瘤菌RND外排转运基因tpaA的功能研究

Rhizobium. leguminosarum 3841 tpa A基因编码RND家族内膜外排转运蛋白,RND外排泵的过量表达是革兰阴性菌细菌抗生素耐药性形成的重要原因之一.采用基因同源重组构建豌豆根瘤菌tpa A基因突变株RLtpa A,并研究了该基因突变对根瘤菌生长、抗生素耐药性以及共生固氮的影响.结果表明,tpa A基因突变会使根瘤菌在AMS基本培养基生长延迟,但不影响其在TY天然培养基中的正常生长. tpa A基因突变可能抑制了根瘤菌中的RND家族外排泵的过量表达,从而使其抗生素耐药性降低.接种了tpa A基因突变株的豌豆植株能形成红色有效根瘤,但其接种根瘤固氮酶活性降低.实时荧光定量RT-PCR分析表明tpa A基因在根瘤类菌体中的表达显著上调.     

棉纤维醛酮还原酶基因促进拟南芥主根伸长

为了研究棉纤维醛酮还原酶基因在参与细胞伸长发育中所起的作用,本研究利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到棉花醛酮还原酶(aldo/keto reductase,AKR)基因c DNA,该基因全长读码框为1134 bp,编码377个氨基酸。氨基酸序列生物信息学分析表明Gh AKR蛋白具有较高的保守性,包含氧化还原酶、醛酮还原酶结合位点和跨膜信号序列等功能序列和位点;进化树分析显示Gh AKR与可可(Tc AKR)的亲缘关系较近。q RT-PCR和酶活性分析表明Gh AKR基因与纤维细胞的快速伸长发育密切相关,尤其在开花后5-15 d纤维快速伸长发育时期具有较高的表达。构建35S::Gh AKR过量表达载体并转化野生型拟南芥(哥伦比亚生态型),转基因拟南芥的主根伸长发育获得了显著的促进,与野生型相比,转基因拟南芥主根伸长增加了约1.4倍。拟南芥根中甲醇和乙醇含量分析显示,转基因拟南芥根中具有较高的甲醇和乙醇积累。这些结果表明棉纤维Gh AKR基因与纤维细胞伸长发育联系紧密,可能通过增加细胞内的醇含量进一步促进细胞的伸长。本研究可为棉花Gh GAKR基因参与纤维伸长发育分子机制解析,以及利用基因工程培育优质棉花品种提供一定参考。     

拟南芥AAP6基因的克隆与转化马铃薯的研究

氨基酸透性酶(AAP)是植物中的氨基酸转运蛋白,在氨基酸转运过程中发挥着重要作用.以野生拟南芥(生态型col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆得到拟南芥中的氨基酸透性酶基因(At AAP6).该基因全长1,446,bp,构建At AAP6基因的植物表达载体pCAMBIA2300-At AAP6,并利用农杆菌介导的遗传转化方法在马铃薯品种"早大白"中异源过表达At AAP6基因.经过抗性筛选与植株再生,成功得到马铃薯转基因植株,并诱导得到转基因马铃薯微型薯.RT-PCR结果表明,At AAP6基因在转基因马铃薯中都能正常地转录表达.这一研究为进一步开展At AAP6基因功能验证,提高马铃薯块茎中的氨基酸以及贮藏蛋白的含量提供了研究基础.     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)Toc33基因编码区的克隆及序列分析

以诸葛菜（Orychophragmus violaceus）新鲜嫩叶为材料提取总DNA，并以其为模板，根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana）Toc33基因的编码序列，设计一对PCR引物，扩增诸葛菜叶 本外膜蛋白转运器构件蛋白基因Toc33，得到两条扩增带，将这两条带分别割胶回收，与T载体连接转化E.coli，筛选重组子并测序，结果表明克隆到的这两个片段分别长1475bp，1573bp，通过同源性比较发现，它们之间的同源性达到88％，这两个片段与拟南芥Toc33基因有较高的同源性，分别命名为OvToc33-1,OvToc33-2。参考拟介Toc33外显子和氨基酸序列，分别确定了所克隆的两信诸葛菜Toc33基因片段的7个外显子和6个内含子，得到了诸葛菜Toc33基因的全编码区序列，并推导了其氨基酸序列，这两个DNA序列与拟南芥Toc33基因编码区的同源性分别高达91.8%和92.4%，说明这一蛋白是高度保守的。     

棉花DELLA蛋白GhGAl4a基因在拟南芥中功能初步分析

为了探究棉花DELLA蛋白基因GhGAI4a在拟南芥中的功能,构建植物表达载体pBP35S：GhGAI4a和pBP35S：Ghgai4a,利用农杆菌介导的花滴法将其转入Col野生型拟南芥。结果显示,2个载体各自获得6个独立的转基因拟南芥纯合株系。分别统计48—96h种子萌发率,测量生长7d后幼苗的主根长度,与非转基因植株相比,过量表达GhGAI4a、Ghgai4a对拟南芥种子萌发及主根生长具有明显的抑制作用。1μmol／LGA处理转基因植株,GhGAI4a转基因植株主根长和萌发率均增大,而Ghgai4a转基因植株主根长度和萌发率均无显著变化。     

AhBG1转基因拟南芥的ABA敏感性和抗旱性研究

为探究花生基因AhBG1对拟南芥ABA敏感性和抗旱性的影响,以过表达AhBG1拟南芥为材料,检测其ABA敏感性及脱水处理下ABA质量分数、叶片失水率、干旱存活率及ABA稳态相关基因表达变化.结果表明:AhBG1是编码花生β-葡萄糖苷酶的家族成员,定位于细胞质;与野生型相比,AhBG1过表达拟南芥植株在干旱条件下体内AB...     

齿瓣石斛AP3基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从石斛花序中克隆了MADS-box家族AP3基因,该基因全长947 bp,包括完整的编码区、5'-UTR和3'-UTR,编码227个氨基酸.生物信息学分析表明,该基因编码相对分子量为26.5 KD的碱性疏水蛋白,具有保守MADS区和半保守K区结构域,与蝴蝶兰和拟南芥AP3同源蛋白相似性高达92%和90%.     

斧翅沙芥蔗糖转运蛋白基因PdSUT4的克隆与表达分析

通过5′和3′cDNA末端快速扩增方法获得PdSUT4基因序列,利用生物信息学软件预测蛋白质理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性,同时用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行PdSUT4基因表达模式分析.结果表明,从斧翅沙芥克隆得到的PdSUT4基因cDNA全长为2005 bp,开放阅读框1536 bp,编码511氨基酸,相对分子质量为55087.44,等电点为9.26,PdSUT4蛋白含有12个跨膜结构域,具有高等植物蔗糖/H~+共转运家族和协助扩散超家族的保守结构域,与多种植物SUT4基因编码的蛋白有较高的一致性;干旱胁迫下斧翅沙芥PdSUT4基因表达量迅速升高.PdSUT4基因的克隆与表达分析为进一步研究该基因在斧翅沙芥生长发育、逆境生理的生物学功能奠定了基础.     

棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白Gh GAI2b基因,构建p BP35S:Gh GAI2b和p BP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白Gh GAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白Gh GAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。     

一个NBS-LRR蛋白质基因转化水稻及其超量表达

水稻Osxoc1334是一个编码NBS-LRR类蛋白质的基因,通过构建该基因的超量表达载体,并在农杆菌EHA105介导下转化中花11号水稻,最终获得6株再生水稻植株.对抗性愈伤组织和再生植株用GUS组织化学染色检测,结果抗性愈伤组织和6株再生水稻植株均可染上蓝色,而野生型植株不变色,用潮霉素磷酸转移酶基因的特异引物进行PCR鉴定,再生植株均可扩增到目标条带而野生型植株则不能,表明Osxoc1334基因已随T-DNA整合到再生水稻植株基因组中.采用半定量和荧光定量PCR分析转基因水稻的Osxoc1334基因表达,结果其中3株转基因植株的Osxoc1334基因平均相对表达量明显增强,其中1株为野生型植株的23.5倍.这为进一步鉴定该基因功能奠定了基础.