携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的研究中得到有效应用     

副粘病毒Tianjin株F基因真核表达载体的构建及初步鉴定

为研究仙台病毒主要表面抗原f蛋白对小鼠的免疫效果,应用RT-PCR从副粘病毒Tianjin株基因组中扩增出F基因,将其插入pcDNA3的Pcmv下游,构建了F基因真核表达载体,同时使用PCR、限制性酶切和测序等方法对其进行了鉴定,鉴定结果证实构建成功.构建好的F基因真核表达载体可为下一步的体外表达和动物免疫实验奠定基础.     

拟南芥HKT1基因pCAMBIA载体构建及转基因材料筛选

探索盐胁迫作用机理并将其运用到农业生产领域中,对培育耐盐作物具有非常重要的现实意义.土壤环境中过量的Na+会干扰植物根对其他离子的吸收,导致植物生理代谢紊乱、离子失衡.在拟南芥中,已有研究证明HKT1基因在盐胁迫信号通路中扮演十分重要的角色,控制着Na+的吸收、转运和储存.文章通过正向和反向遗传学手段,发现一个转录因子...     

植物MYC1基因拟南芥表达载体构建及鉴定分析

随地球环境污染,气候变化问题愈发严重,植物生长过程中面临的极端环境风险也随之增加,植物所受环境胁迫中缺铁胁迫广泛存在。文章以拟南芥基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增克隆拟南芥MYC1基因启动子区域,经过酶切和连接,与GUS(β-葡萄糖苷酸酶)表达载体构建融合表达载体ProMYC1-GUS。通过浸花法侵染野生型拟南芥植株获得转基因材料,并对ProMYC1-GUS转基因材料进行缺铁诱导GUS组织染色,证明植物MYC1基因在缺铁胁迫下表达受到抑制。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

百合花发育相关基因LLGLO1的RNAi载体构建

百合花发育相关基因的研究是开展花卉分子育种的重要基础。以麝香百合(Lilium longi-florumThumb.)未开放的花蕾为材料提取总RNA。根据LLGLO1序列的同源比对选取特异区段,设计引物扩增区段cDNA并引入酶切位点。将PCR扩增片断连接到T载体上,经酶切及PCR验证后进行测序。测序结果表明:用于RNAi的cDNA片断与LLGLO1序列完全相同。通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,RNA干扰片断经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1301中形成ihpRNA结构。PCR及双酶切鉴定结果显示,构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。     

含Syntaxin 1A基因的SFV表达载体的构建与表达

用绿色荧光蛋白 (EGFP)标记了Syntaxin 1A(Syn1A)蛋白 ,构建了含有EGFP Syn1A融合蛋白的森林脑炎病毒表达载体 pSFV1 EGFP Syn1A ,测序结果表明表达载体构建正确 .用荧光显微成像技术研究了Syn1A在原代大鼠胰腺 β细胞中的定位 ,结果表明Syn1A主要定位于细胞质膜上 .     

表达HIV-1复合多表位基因的p815细胞稳定株的建立和评价

建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+).在阳离子聚合物作用下重组真核质粒转染的p815(H-2d)细胞, 以G418压力筛选,RT-PCR检测mRNA表达,间接免疫荧光检测蛋白表达.通过PCR获得了HIV-1 p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG融合基因,成功构建了p24MEG基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/p24MEG.转染p815细胞后, RT-PCR检测到融合蛋白mRNA表达,间接免疫荧光显示 p815细胞内有融合蛋白的表达.结论:建立了稳定表达HIV-1p24MEG融合蛋白的p815细胞克隆,为评价多表位抗原p24MEG在BALB/c小鼠体内诱导的细胞免疫应答奠定基础.     

NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS的构建及鉴定

目的核干细胞因子(nucleostemin,NS)是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质,可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点.本文旨在构建靶向NS干扰载体p Genesil-1-NS,为后续实验奠定基础.方法基于已发布的NS mRNA序列(NM_206825),选取5'-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3'(397-416)作为候选靶序列,按shRNA载体设计原则,设计合成两条互补DNA链,退火后插入载体,并以酶切和测序鉴定重组转化子.结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体.结论成功构建NS特异性干扰载体p Genesil-1-NS,可用于NS在肿瘤中的功能研究.     

IFI16基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为了构建可在人喉癌细胞中稳定表达 IFI16基因短发夹RNA（shRNA）的表达载体,设计合成的IFI16基因shRNA片段,连接到经BamH I和 EcoR I双酶切的pGreenPuroTM shRNA表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取几个抗性菌落,用PCR技术初步进行鉴定,经PCR初步鉴定为重组质粒的一个重组子DNA用测序进一步鉴定,测序结果显示成功构建了 IFI16基因shRNA的表达载体pGreenPuro-IFI16 shRNA 。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

组织型纤溶酶原激活剂突变体基因转染细胞株的建立

以脂质体介导法将含有t-PA突变基因的真核表达载体pCSRA及pCSRK分别转染CHO-dhfr^-,经G418及DMEM双重选择,获得两者的稳定表达细胞株。结果表明,表达产物具有良好溶纤活性;Western印迹实验证明,产物具有特异抗原性;经多次传代,细胞株具有良好的稳定性。比较了无血清培养基CHO-S-SFMⅡ与常规培养基DMEM培养条件下pCSRK细胞株产物的表达量,前者约为后者的2倍,表明无血清培养基SFM有可能用于药用性蛋白的生产。实验为t-PA新型突变体的临床应用打下一定基础。     

毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选

构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1 cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+ 10％ FBS、37℃5％CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.     

COPS3的稳定干涉细胞系建立及其在NLRP3炎症小体激活中的作用

COPS3(COP9 Signalosome Subunit 3)作为COP9信号复合体的第三个亚基,在多种恶性肿瘤中高表达。本实验室通过酵母双杂交系统筛选,发现COPS3与NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3)存在相互作用。目前关于COPS3与NLRP3炎症小体的相关性未见文献报道。为了研究COPS3对NLRP3炎症小体的影响,我们利用慢病毒感染系统建立了稳定干涉COPS3的THP1细胞系,首先将COPS3的不同干涉序列片段稳定整合到THP1细胞中,通过嘌呤霉素压力筛选,应用实时定量荧光PCR(Real time PCR)手段检测COPS3的干涉效果,最终确定成功建立干涉COPS3的稳定细胞株。在稳定敲低COPS3的细胞株中,我们发现NLRP3 炎症小体的激活受到明显抑制。综上提示,COPS3能够正向调节NLRP3炎症小体的激活。     

表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定

通过PCR扩增获得大鼠FoxA1的cDNA,构建慢病毒重组载体plv-rFoxA1-IRES-EGFP,并瞬时转染293T细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Western blot检测FoxA1的表达.通过钙转将该重组载体与辅助质粒△8.91,pVSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.研究结果表明,大鼠FoxA1慢病毒质粒成功构建,并且证实所制备的慢病毒能感染细胞,使细胞有效表达FoxA1蛋白,为FoxA1的功能研究奠定了材料基础.     

Construction and expression of inverted configuration of retroviral vector containing intron 1 of hFIX

Intron was found to play an important role in improving gene expression. To improve the human factor IX(hFIX) expression level in hemophilia B gene therapy study, the retroviral vector containing intron 1 of hFIX gene was constructed in forwarded configuration, but the intron 1 was found spliced in virus particles by RT_PCR detection. So the inverted configuration vector G1NaPAi′IX was suggested and constructed on the basis of SNMBAIXm and transfected into PA317. Then C2C12 cells were transfected using the above virus supernatant and the G418_resistant clones were selected. PCR and RT_PCR detection found that intron 1 structure existed in C2C12 clones and retroviral particles. And the expression level of inverted vector was 3 times higher than that of forwarded vector. These results showed that the inverted configuration vector was in deed able to avoid splicing of intron 1 during the process of retroviral packaging and improved the expression level of hFIX protein.     

OsICK1基因植物反义表达载体的构建及遗传转化

OsICK1是水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因．我们构建了水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（OsICK1）的植物反义表达载体，在农杆菌的介导下尝试使antisense OsICK1整合到水稻基因组中并初步得到验证．为进一步研究OsICK1对水稻细胞周期调控的作用奠定了基础．     

甜味蛋白thaumatin-PDI二价植物表达载体的构建

将thaumatin cDNA和PDI基因的上游分别连上启动子,下游连上终止子,通过基因重组技术,克隆到植物表达载体pCAMBIAl302中,构建成一个同时含有thaumatin基因和PD／基因的新的植物二价表达载体pCAMBIAl302-tha-PDI.经测序,该表达载体中的thaumatin基因与PDI基因的编码阅读框序列完全正确。