人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定

构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原（Proinsulin）的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM－T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组载体pcDNA3.1( )／Proinsulin,测序后在真核细胞COS－7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸（C肽区）有一CAG（Glu)→CGG（Arg）的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS－7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。     

日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析 Ⅰ.未成熟卵28kDa分子的快速分离纯化与鉴定

为了进一步研究日本血吸虫天然抗病分子(SIEA 28 kDa)的结构与功能,采用SDS-PAGE制备电泳和电洗脱法从日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)中快速分离纯化了SIEA 28 kDa抗原分子,纯化后抗原分子经梯度凝胶电泳分离,重复测定其分子量。同时,采用Western blot和ELISA检测SIEA 28 kDa分子的免疫活性及其生化纯度。证实获得的提取物SIEA 28 kDa抗原分子的纯度高、活性好;用该抗原分子免疫家兔获得的单特异性抗血清可同时识别日本血吸虫未成熟虫卵、雌虫和雄虫的28 kDa抗原组分。说明该分子与日本血吸虫成虫(AWA)28 kDa组分具有部分交叉抗原性。     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

曼氏血吸虫单克隆抗体与日本血吸虫抗原的反应

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测曼氏血吸虫单克隆抗体(Mc Ab)H417与日本血吸虫31/32kd抗原、斯氏狸殖吸虫成虫粗抗原、旋毛虫幼抗原及猪囊虫抗原的反应,结果显示,Mc AbH417旋毛虫、斯氏狸殖吸虫及猪囊虫抗原反应时,其消光值极低,而当日木血吸虫抗原与Mc AbH417反应时,其消光值读数较高,且与抗原稀释度呈线性关系.结果提示,抗曼氏血吸虫的Mc AbH417能识别异源性血吸虫抗原.     

日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析 Ⅱ.SIEA 28kDa分子的高效液相色谱分离及薄层等电聚焦分析

采用高效液相离子交换法对电泳纯SIEA28kDa抗原组分进一步分离纯化。对获得的色谱纯SIEA28kDa抗原分子进行薄层等电聚焦分析,测定其等电点。结果证明电泳纯SIEA28kDa抗原分子经高效液相离子交换法纯化后,280nm,220nm波长色谱图均为一个两侧对称,光滑的高峰曲线,色谱洗脱液对其免疫活性光密度图也为一个两侧对称,光滑的高峰曲线,色谱纯化证明SIEA28kDa抗原组分可能为单一分子,其等电点范围在pi5-pI7之间。     

日本血吸虫天然抗病分子疫苗的结构与功能分析I.未成熟卵28KDa分子的快速分离纯化与鉴定

为了进一步研究日本血吸虫天然抗病分子（SIEA28KDa）的结构与功能,采用SDS-PAGE制备电泳和电洗脱法从日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原（SIEA）中快速分离纯化了SIEA28KDa抗原分子,纯化后抗原分子经梯度凝胶电泳分离,重复测定其分子量,同时,采用Western blot和ELISA检测SIEA28KDa分子的免疫活性及其生化纯度。证实获得的提取物SIEA28KDa抗原分子的纯度高、活性好;用该抗原分子免疫家兔获得的单特异性抗血清可同时识别日本血吸虫未成熟虫卵、雌虫和雄虫的28KDa抗原组分,说明该分子与日本血吸虫成虫（AWA）28KDa组分具有部分交叉抗原性。     

基于转录本组和蛋白质组数据的日本血吸虫候选疫苗分子序列的预测和分析

预测了可能模拟致弱疫苗免疫保护性效果的日本血吸虫抗原分子,为实验鉴定抗日本血吸虫候选疫苗分子提供基础.实验基于已发表的辐照尾蚴转化的童虫的特征性转录本组(曼氏血吸虫)和蛋白质组(日本血吸虫)序列,用BLASTP算法等搜寻来源于正常日本血吸虫童虫和成虫的转录本组和蛋白质组中的序列;应用在线软件、相关数据库及文献对这些序列进行序列注释分析.结果获得了与辐照尾蚴转化的童虫特征性表达的分子同源或一致的日本血吸虫序列131条,它们较高比例地出现在正常童虫高表达的分子集类中;进一步文献分析预测得到了52个日本血吸虫候选疫苗分子,它们的序列特征与存在于血吸虫体被的一些分子和已知的抗血吸虫疫苗分子的相类似.用数据挖掘技术获得了一批日本血吸虫候选疫苗分子,为进一步实验研究奠定了基础.     

日本血吸虫CDNA文库的构建及功能性抗原基因的克隆、筛选和鉴定

采用一步法提取MRNA及定向克隆技术,构建了日本血吸虫(中国大陆株)CDNA文库;应用多种不同特色的血清以免疫学方法筛选文库;系统的报道了日本血吸虫22.6KD基因克隆和在大肠杆菌中的高效表达、分离纯化、免疫原性及特性分析,填补了国内空白.     

日本血吸虫体壁抗原基因的获取与功能分析

全球变化科学为可持续发展提供了科学理论基础,但可持续发展也对伞球变化科学具有指导意义,并由此发展出一项伞新的研究:可持续性科学.可持续性科学产生的背景足我们目前生活在一个大转变时期,这些转变体现在两大方面,一是包括气候变暖、土地变化和生物多样性的损失等的地球环境变化,二是包括人品增长与老化、城市化、经济伞球化与贫富不均等社会转型.如何更好地理解这些变化并使这些变化过程向着可持续性目标转变,是可持续性科学的重大挑战.创新性、内生化和协调共振是可持续性转变的特征.目前的伞球变化科学无论在研究的目标和对象,还是在介入的方式和方法上都不能满足社会的需要,而新m现的可持续性科学却能在自然科学和社会科学之间搭起坚实的桥梁,探索环境和发展的长期趋势是如何朔造自然与社会的相互作用.     

Construction of multivalent DNA vaccines forMycobacterium tuberculosis and its immunogenicity

The coding regions of Ag85B MPT-64, and ESAT-6 secreted proteins were cloned initially into the eukaryotic expression vector pJW4303, then transformed to E. coli Top 10 strain for plasmid DNA extraction and further analysis. Plasmids containing the right insertion were sequenced to confirm their identity. COS7 cells were transfected with a mixture containing serially diluted plasmid DNA encoding three secreted proteins and Lipofectin (Gibco). The supernatants and pellets prepared from various cell lines were run on SDS-PAGE gel and the expression of these proteins in COS7 cells were demonstrated by immunoblot using polyclonal or monoclonal antiserum of M.TBH37Rv. 21 days after first vaccination of C57BL-6 mice by all three recombinant eukaryotic expressing vectors, antibody titer for Ag85B reached 1∶3200. 21 days after second vaccination, the antibody titer reached 1∶102400. The highest antibody levels induced by multivalent vaccines after the second injection were equal to or even greater than the highest antibody levels of single DNA vaccine reported in literature after third injections. Antibody titer of MPT-64 was 1∶50 after the first injection and it reached 1∶200 after the second injection. No antigen-specific antibody against ESAT-6 was detected in sera harvested from immunized mice 21 days after both injections. Antigen-specific IFN-g level of Ag85B was 110 pg/mL while no antigen-specific IFN- g level of ESAT-6 and MPT-64 was detected even after third injections. To our knowledge, it is the first time that studies of polyvalent recombinant DNA vaccines against TB were carried out in C57BL-6 mice. Our results indicated that multiple DNA vaccines could be used to enhance protective responses against M.TB.     

重组IL-5质粒pVAX1-mIL-5增强卵透明带DNA避孕疫苗黏膜免疫效能

目的:探讨利用白细胞介素5作为DNA疫苗佐剂增强黏膜免疫反应,提高卵透明带DNA避孕疫苗抗生育效能的可行性。方法:用pVAX1-m IL-5和卵透明带避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒口服免疫雌性小鼠,共设3组,每组6只。A组单独用50μg pVAX1-pZP3α免疫;B组用疫苗加等量的pVAX1-m IL-5质粒为佐剂共免疫;C组为空白对照组。每组动物接受3次免疫(第0、3、6周)。采用ELISA法检测小鼠血清及阴道冲洗液中抗pZP3 IgA抗体。第10周雌雄交配,统计雌鼠怀孕情况;第16周取双侧卵巢作石蜡连续切片,光镜观察卵巢病理学变化。结果:B组全部小鼠血清抗体呈阳性反应,A组只有3只小鼠血清抗体呈阳性反应,且B组小鼠的抗体滴度水平均高于A组小鼠;抗生育率B组小鼠为100%,A组小鼠为50%,C组小鼠为0%,2检验分析结果表明各组间的差异有统计学意义,抗生育效能与交配时抗pZP3 IgA抗体的强度有关;卵巢切片的组织病理学观察结果表明,有抗生育效能的小鼠卵巢组织可观察到各级形态正常的卵泡,无淋巴细胞浸润,与对照组及无抗生育效能的小鼠卵巢结构无差异。结论:利用重组质粒pVAX1-m IL-5与卵...     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。