红花EST-SSR分子标记开发与初步验证

旨在开发红花EST-SSR标记,为红花分子辅助育种和种质资源评价提供有力工具.先对红花转录组进行测序,选用MISA软件筛选鉴定SSR位点.在云南红花(YH)转录组中,共获得46 016个SSR位点,分布频率为32.09%,平均每3.11 kb有一个SSR.云南红花SSR位点以二,三核苷酸重复基序为主,其优势重复基序分别为AG/CT(44%)和AAG/CTT(24%).SSR位点重复次数相差较大,其中重复为5次比率最高,SSR位点数为9 369(26.63%),其次为6次(8 148, 23.16%).同时,利用Primer3.0进行引物设计,随机筛选27对引物,在60份不同来源红花种质中进行多态性验证,获得12对具有多态性稳定的引物,多态性引物比率为44.4%.结果表明,基于红花转录组序列开发SSR标记是可行的,开发的标记具有稳定扩增性,丰富多态性等优点,开发的SSR标记将有助于红花功能基因挖掘,遗传连锁图谱构建和遗传多样性分析.     

青海小海绵羊肚菌M12-10转录组SSR信息分析及其分子标记开发

为明确羊肚菌转录组SSR总体特征、开发出适用于分子育种的SSR引物,对分离自青海大通的小海绵羊肚菌M12-10菌丝体高通量转录组测序,采用MISA分析小海绵羊肚菌M12-10转录组SSR位点信息,利用Primer 3.0设计引物,并选择12对引物将19株不同种、不同采集地的野生羊肚菌进行聚类分析。结果表明:高通量测序组装得到153 326个转录本,100 672个SSR位点分布在20 043条Unigenes基因上;SSR发生频率为19.9%,单核苷酸(9 268,46.0%)和三核苷酸(5 183,25.0%)是主要的重复类型,优势重复基元为A/T(33.0%)、GA/AG(12.0%)和TGC/CAG(40.0%);基序长度集中在10～20bp的比例为73.9%,具有高多态性。基于SSR的20 043条Unigene成功设计了14 894对引物,随机筛选的12对SSR引物中4对引物表现稳定可重复的多态性;遗传相似系数为0.55时,19株羊肚菌菌株分为两类;相似系数为0.84时,19株羊肚菌全部分开。故基于小海绵羊肚菌M12-10转录组数据SSR标记开发是可行有效的,筛选的4对高频率、高多态性的SSR引物将有助于开展种质资源评价和遗传多样性分析。     

茄子种质资源的农艺性状与SSR标记的遗传多样性研究

为了明确茄子种质资源的遗传背景,对从国内搜集,并在云南试种表现良好的37份茄子种质资源进行9个农艺性状和6个SSR标记的遗传多样性分析.结果表明,茄子9个农艺性状的变异系数在8.99%~44.69%之间,变异系数最高的是果形,最低的是果实横径;SSR标记共检测到13个等位变异,平均每个SSR位点的等位基因数为2.166 7个,平均有效等位基因数为1.862 0,Shannon’s信息指数为0.659 1,多样性指数为0.4399.非加权算术平均法(UPGMA)聚类分析表明,9个农艺性状将37份茄子种质资源划分为4个类群;6对多态性SSR引物也将所有种质划分为4个类群.虽然2种聚类方法把37份种质基本分开,但大部分种质的分子标记与农艺性状的聚类结果一致性不高.同时,农艺性状和SSR标记的结果均表明,37份茄子种质资源遗传多样性并不丰富,亲缘关系较近.以上结果可为茄子种质资源的进一步研究和利用提供理论依据.     

杉木育种群体SSR分子标记遗传多样性分析

杉木的育种群体中,维持合理的遗传多样性和清晰的遗传背景,是长周期、多世代遗传改良采用的核心策略之一。基于基因组分子标记,利用自主开发的52对杉木SSR引物,对国家级杉木种质资源库保存的遗传材料——杉木第1代遗传改良收集的93份种质资源进行了遗传多样性分析。结果表明:52对SSR引物在93份材料中共检测到254个等位变异,等位变异范围为2～8个,平均等位基因数为4.88个,平均有效等位基因数为2.32个,平均观察杂合度为0.43,平均Nei’s多样性指数为0.50,平均Shannon信息指数为0.98,这5个评价遗传多样性水平的指标具有较大程度的一致性。不同引物的等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度、多样性指数和Shannon信息指数等均表明杉木育种群体中存在较大的遗传差异,其变异系数分别为24.88%、44.75%、34.20%、34.89%和33.59%。93份种质资源间遗传相似系数的平均值为0.693 3,变化范围为0.490 0～0.919 3; 遗传距离的平均值0.370 3,变化范围为0.086 3～0.713 4。当距离阀值为20时,可将杉木第1代育种群体中的93份种质资源划分为5大类; 当距离阀值为15时,第5大类的77份种质资源可细分为16个亚类。SSR分子标记聚类的结果可为种质资源的管理及提高育种效率提供重要依据。     

基于RNA-seq的崇左金花茶EST-SSR标记开发

本研究分析了崇左金花茶(Camellia chuongtsoensis)转录组水平的EST-SSR特征.从崇左金花茶转录组数据组装获得的35 410个Unigene中,共鉴定出2~7不同核苷酸重复类型的SSR位点7 754个,分别分布于6 394条序列中,其中1 121个Unigene具有两个以上的位点.在转录组中SSR位点出现频率为21.90%,分布密度为1/3.6kb;在所有重复单元中,二碱基微卫星占主要优势,占SSR位点总数的61.3%.利用Primer 3.0设计引物,共计3 303条Unigene成功设计出引物.随机选择10对SSR引物,对一个崇左金花茶群体进行扩增多态性分析,8对引物能够扩增出符合预期大小的PCR片段,其中4对引物成功检测出多态.以上结果表明,转录组数据能够提供丰富的SSR位点,用于快速高效地开发SSR引物,所开发的引物可为崇左金花茶遗传多样性的研究以及种质资源的鉴定与保护等方面提供分子基础.     

云南松转录组SSR的分布及其序列特征

分析云南松转录组中的SSR位点信息的分布及其序列特征,为SSR引物的开发做前期工作.从80000条转录组Unigene序列中,搜索到2455个SSR,出现频率为3.07%,分布的平均距离29 kb.SSR以三、二核苷酸占优势,分别占总数42.73%和27.25%,而以四核苷酸的较少,仅占总数的0.98%.重复片段长度12~25bp,其中近90%的集中在12~20bp,平均16.09bp.AT/AT与AGC/CTG和AAG/CTT为二、三核苷酸优势重复基元,分别占基元总数的16.66%、9.65%和8.39%.从2899对引物中随机挑选32对引物用于检测,24对成功扩增.云南松转录组SSR位点出现的频率较高,分布距离较近,基元类型丰富,重复次数较高,具有较高的多态性潜力.云南松转录组产生的Unigene是开发SSR的有效来源,获得的SSR引物可为云南松种质资源的遗传变异研究提供更多的标记.     

基于高通量转录组测序技术的龙头鱼微卫星信息分析

为龙头鱼资源合理开发与保护提供有效分子标记,本研究利用IluminaHiSeq~(TM) 2500高通量测序平台对采自舟山近海的龙头鱼肌肉组织进行转录组测序,从获得的Unigenes序列中挖掘SSR位点信息并分析其分布及特征。结果显示,测序所得29 756条Unigenes中共识别出5 652个完美型SSR位点,序列总长度为86 517 bp,相对丰度为332.97个/Mb。龙头鱼转录组SSR以单碱基和二碱基重复类型居多,分别占SSR总数的67.59%和20.72%。6类完美型SSR共有重复基元148种,重复次数以10次为主,占总SSR的23.23%。SSR序列长度范围在10～92 bp之间,其中序列长度在12 bp及以上的SSR位点的含量为65.73%。综上所述,龙头鱼转录组SSR位点含量丰富、基元重复类型众多、重复次数较高,具有良好的分子标记开发潜力,获得的SSR标记可用于遗传多样性和系统发育关系研究。     

扁玉螺转录组SSR信息分析

采用生物信息学方法分析扁玉螺转录组文库EST序列(SSR)位点,并且设计简单重复序列(SSR)引物,以期为扁玉螺分子标记辅助育种提供有力的工具。对扁玉螺进行转录组测序采用Illumina Hiseq~(TM)高通量测序平台,再利用Micro SAtellite(MISA)工具,分析扁玉螺转录组中SSR的重复基元及其分布频率。利用Primer 3软件设计引物,并且通过SSRFinder筛选出SSR引物。从233 853条Unigenes中找到202 337个符合条件的SSRs,发生频率为45.34%,SSR位点的出现频率为86.53%。SSR位点中单核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的63.44%,其次为双核苷酸和三核苷酸,分别为24.12%和6.73%。SSR所包含的重复基元中,单核苷酸重复基元A/T最多,占总SSR的54.15%;其次为双核苷酸AC/GT多,为15.9%。扁玉螺转录组中SSR位点出现频率高,而且类型丰富;大量的SSR分子标记技术有助于扁玉螺分子育种与遗传多样性分析提供更多的依据。     

湿地松转录组SSR分析及EST-SSR标记开发

【目的】湿地松是南方地区优先推广的优质产脂树种。但湿地松分子遗传基础薄弱,基因组序列信息匮乏,影响了湿地松基因组学的深入研究。目前,湿地松分子研究所用的SSR标记主要来自其他近缘种或利用公共数据库中有限的基因序列资源开发的SSR标记,其多态性和通用性较差。为解决这一问题, 笔者根据湿地松转录组测序数据开发EST-SSR位点,并揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为湿地松分子标记辅助育种奠定基础。【方法】利用MISA软件对转录组序列进行SSRs查找和分布特征分析。查找标准参数设置为: 单核苷酸重复>10次,二核苷酸重复>6次,三、四、五、六核苷酸重复>5次。根据SSR位点两端的保守区域,利用Primer3.0设计并随机挑选120对SSR引物,通过琼脂糖电泳和毛细管电泳对来自美国和吉安的113份家系个体进行遗传多样性分析,确定引物多态性。【结果】79 574条unigenes序列中搜索到3 818个SSR位点,出现频率为4.80%,平均18.27 kb出现1个SSR位点,3 373个unigenes含有SSR位点,SSR发生频率(含SSR位点的序列数/搜索序列总数)为4.24%,其中2 980条序列含1个SSR位点,含1个以上SSR位点的序列有393条。在检测到的3 818个SSR标记中,单核苷酸分布最多,其次是二核苷酸和三核苷酸,SSR数量分别占总数的63.54%、19.15%和16.27%,而四、五、六核苷酸重复类型所占比例较小,分别为0.52%、0.13%和0.31%。SSR重复单元的重复次数分布在5~22次之间,除单核苷酸重复外的1 391个SSR中,重复5次的数量最多,为498个(35.80%);重复6次和7次的次之,分别为417个(29.98%)和198个(14.23%);重复10次以上的仅有38个(2.73%)。在检测到的731个二核苷酸重复SSR中,最常出现的重复单元为AT/AT,数量为491个(12.86%),AG/CT和AC/GT两种类型的重复单元出现的次数次之,分别为156(4.09%)和81个(2.12%)。在检测到的621个三核苷酸重复中,AAT/ATT是出现频率最高的单元,共139个(3.64%),其次是AAG/CTT,共122个(3.20%)。3 818个SSR中有24.59%的位置未知,其余的SSR则分布在非编码区域(untranslated region,UTR)或者编码区(coding sequence,CDS)上,分布数量表现为3'UTR>5'UTR>CDS。参试的120对SSR引物,有92对扩增成功(76.78%),其中24对呈现多态(20%)。24对引物(13个二核苷酸重复、7个三核苷酸重复和4个四核苷酸重复)共检测出81个等位基因,每个位点的等位基因数为2~9,平均为3.38个。多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)为0.103~0.726,平均为0.349。【结论】通过对湿地松转录组数据的挖掘,共获得 3 818个SSR位点,主要重复单元为AT/AT和AAT/ATT,可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于湿地松转录组序列的SSR标记开发是可行的。     

基于转录组序列的小麦ETS-SSR标记筛选与染色体定位

通过小麦转录组序列分析,获得121 210个非重复序列(Unigenes),在10 672(8.8%)个Unigenes中搜索出1-6个重复基元的11 650条EST-SSR信息位点,筛选并设计出308条SSR引物,选取前30对引物进行合成.有效性扩增检测结果表明,20(66.7%)对引物有清晰条带.利用缺体-四体系共定位了14对引物,分别位于13条染色体的21个位点上.研究表明,利用小麦转录组中EST-SSR信息开发新的SSR标记是可行的,开发的新ESTSSR标记可有效用于小麦基因的定位和遗传多样性的分析等.     

棉花种质资源多样性的ISSR聚类分析及主成分分析

利用ISSR分子标记对48份棉花种质资源的亲缘关系及遗传多样性进行分析,结果显示,筛选出的10个ISSR引物扩增出的112条带中,多态性条带占101条,为总条带的90.18%.每个引物均可扩增4～21个多态性位点,平均10.10个,引物平均多样性信息指数(PIC)和多态性谱带百分率(PPB)分别为0.76和87.88%.利用NT-SYSpc 2.1统计分析软件中的UPMGA法对48份棉花种质资源构建亲缘关系树状图,在遗传相似性系数(GS)为0.66水平上可将所有参试材料聚成两大类,且与主成分分析(PCA)结果基本吻合.ISSR标记揭示出这48份棉花种质资源遗传多样性较小,遗传基础比较狭窄.     

基于Illumina测序技术的枸杞微卫星引物的开发

目的:分离和鉴定红、黑枸杞基因组中的简单重复序列(SSR)位点.方法:Illumina Hiseq 2000进行红、黑枸杞的高通量转录组测序后,生物信息分析SSR的分布频率和重复基元的类型特征,PCR扩增和聚丙烯酰胺电泳验证SSR位点及引物.结果表明:转录组测序共得到了192,869条reads,总长度205,220,696bp.拼接后序列的数量为35,572条,序列平均长度约为1064bp.从中共预测到44,828个SSR位点,其中单、二、三、四、五、六个碱基重复单元的微卫星位点数分别有25,800、9186、8479、363、464和536个.从中随机选择30个位点,设计引物进行验证.23对引物在红黑枸杞中能扩增出产物,其中5对仅一个材料中有扩增产物,另有5个位点扩增产物能明显区分红黑枸杞.结论:利用Illumina测序技术得到的枸杞转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,对今后枸杞遗传多样性的研究以及种质资源鉴定打下了良好的理论基础.     

口虾蛄转录组微卫星标记开发

采用高通量测序技术获得的口虾蛄转录组测序数据,筛选具有多态性的SSR标记。结果共获得87 355条Unigene,67 657个微卫星位点,其中双碱基重复和三碱基重复的SSR较多,分别有30 235个和17 590个,占总数的44.69%和26%。获得230种重复类型,其中双碱基中的AC/GT重复和三碱基中的AGG/CCT重复是重复次数较多的重复类型。从中挑选碱基重复次数较多的微卫星引物共50对进行合成。用北海24个口虾蛄样品进行验证,获得条带清晰和多态性好的引物6对。6个微卫星位点在口虾蛄北海群体的遗传多样性分析中均表现出较高的多态性。平均有效等位基因数(k)为5.17,观测杂合度(Ho)为0.437 2,平均期望杂合度(He)为0.672 4,多态信息含量为(PIC)为0.602 3,这说明开发的6对SSR标记均适合群体遗传多样性研究。为口虾蛄进一步遗传多样性的研究奠定了基础。     

大分舌蜂EST-SSR微卫星分子标记开发与特征分析

【目的】构建中国油茶（Camellia oleifera）主要传粉昆虫之一的大分舌蜂(Colleles gigas)cDNA文库并利用全国几个典型样本筛选微卫星DNA(Simple sequence repeat，SSR)位点，为该蜂种群遗传多样性和遗传分化研究提供可靠的分子标记。【方法】使用10头大分舌蜂雌性幼虫构建cDNA文库，用Illumina Hiseq TM 2500高通量测序平台测定cDNA文库数据，通过SSR筛选软件MISA进行检索发掘SSR标记；利用Primer Premier 5.0软件设计引物，利用荧光标记技术进行分型。【结果】从cDNA文库序列中筛选得到16 457个SSR，其中15 563个(占比为94.57%)是完整型SSR，872个(占比为530%)是不完整型SSR，22个(占比为0.13%)是复合型SSR；完整型SSR中单碱基SSR最为丰富，共10 910个，占总SSR数量的70.11%，其余依次是二碱基SSR (2 099个，占比为13.49%)、三碱基SSR(2 408个，占比为15.47%)、四碱基SSR(136个，占比为0.87%)和五碱基SSR (10个，占比为0.06%)。对80对EST-SSR引物在6个不同地理种群32头大分舌蜂中进行验证，共有6对EST-SSR引物较好地扩增出目的片段，共获得192个等位基因，平均等位基因数为11.833 332个，平均有效等位基因数为4.149 8个，香农信息指数范围为1.362 6～2.119 2，平均观测杂合度为1.000，平均期望杂合度为0.800，多态信息含量范围为0.710～0.879，且平均值为0.761。【结论】研究所开发的6对大分舌蜂EST-SSR引物对应的产物多态性较高，遗传多样性也较高，可以应用于该蜂种的遗传多样性、遗传分化、种质资源保护等领域的后续研究。     

“石门核桃”种质资源遗传多样性的SSR分析

为了确定“石门核桃”种质资源的遗传多样性,采用SSR标记技术,对20份“石门核桃”实生优株,15份核桃种质资源进行了遗传多样性分析。结果表明,筛选出的16对SSR引物扩增的等位基因变幅为3～10,片段范围100～306 bp,多态性信息含量在0.481 0～0.765 6之间,具有较高的多态性。采用UPGMA法在遗传距离0.26处将35份资源分为5类,麻核桃种质盘龙纹独自聚为1类,“石门核桃”实生资源与其他种质资源分布于其他4类中。     

开口箭种质资源及其混伪品的SSR指纹图谱研究

利用SSR分子标记技术研究开口箭种质资源的DNA鉴定方法,构建其指纹图谱,为开口箭及其混伪品鉴定提供参考依据。应用7对多态性丰富的SSR引物对10份开口箭种质资源和5份混伪品进行了PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果表明,开口箭种质资源及其混伪品的遗传多样性丰富,7对SSR引物共检测出21个多态性位点,平均每对引物的多态性位点数为3.0;基于SSR分子标记的DNA指纹图谱可将开口箭种质及其混伪品完全区分开。该研究建立的SSR指纹图谱可用于开口箭种质资源标准化分析及市场化检测。     

山樱花群体遗传多样性的SSR分析

【目的】分析山樱花不同居群遗传多样性,为其种质资源保护与利用提供理论依据。【方法】利用SSR分子标记对8个山樱花自然居群共224份样本进行遗传多样性分析。【结果】17对SSR引物共检测到113个等位基因,平均每个位点6.647个等位基因,多态位点百分率为92.65%; 物种水平上Nei's遗传多样性指数为0.634,居群水平上Nei's遗传多样性指数、Shannon信息指数分别为0.498、0.939。Structure分析显示8个山樱花居群来自3个基因库,与主坐标分析结果较为一致。【结论】SSR标记可以用于山樱花群体遗传多样性分析,山樱花群体间与群体内遗传多样性均较高。     

基于SSR标记的白栎天然居群遗传多样性分析

[目的]利用SSR分子标记,对白栎天然居群进行遗传多样性分析,为其种质资源的合理开发与保护提供指导.[方法]采用筛选出的SSR引物对3个群体进行遗传多样性与遗传结构研究,并计算遗传参数;基于个体间的遗传距离进行主成分分析,运用GenAlEx 6.5进行遗传距离与地理距离的相关性Mantel检验,软件Arlequin用于...     

胡卢巴种质资源RAPD遗传多样性分析

在优化随机引物扩增多态性DNA标记（RAPD）反应体系和条件的基础上,利用筛选的多态性引物分析了胡卢巴种质资源的遗传多样性．结果表明,19条RAPD引物显示了40份胡卢巴种质资源的遗传距离为0．02～0．70,来源上变幅从大到小为：宁夏和国外种质间、国外种质间、宁夏种质间、国内其他省份种质间．40份胡卢巴种质资源分为两类,即Ⅰ类包括3份国外种质;Ⅱ类包括37份种质,可大体上分为宁夏、国内其他省份和国外种质3个亚类．     

鸟王茶转录组中SSR位点信息分析

为开发鸟王茶分子标记技术,对使用高通量测序所获得的鸟王茶转录组原始数据,经过软件Trinity拼接,共获得161 561条Unigenes,使用软件MISA进行SSR位点搜索,共得到51 453个SSR,分布于36 691条Unigenes中,总长度为554 050bp,发生频率为31.85%,平均分布频率是1/1.79kb,平均长度为10.77bp。在鸟王茶转录组SSR中,二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要的重复类型,分别占总SSRs的45.05%和13.86%。鸟王茶转录组SSR种类共有223种重复基元类型,其中优势重复基元是A/T、AG/CT、AC/GT它们所占比例分别是:36%、32%、13%,这3种重复基元,占总SSRs的比例是81%。