GLP-1-Fc融合蛋白在DG44细胞中的表达及其质量分析

构建GLP-1-Fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株。收集发酵培养上清,通过离心、过滤及亲和层析等方法对目的蛋白GLP-1-Fc进行分离纯化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法、Edman降解等方法进行目的蛋白的质量分析,以建立GLP-1-Fc融合蛋白发酵、纯化工艺,探索该融合蛋白的质量检测方法。本实验成功构建了表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44悬浮型细胞株,通过该工艺流程,GLP-1-Fc融合蛋白表达量达到400 mg/L,纯度达95%,分子量约为3.0×10~4。该生产工艺能够获得与理论目标蛋白相一致的、且结构稳定GLP-1-Fc融合蛋白,其质量检测方法稳定可靠。     

铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化.方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32a( )上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度.结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%.结论:在pET32a( )表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础.     

间质胶原酶活性中心肽段的制备与表征

利用Fmoc固相合成法合成了一种基质金属蛋白酶—间质胶原酶（MMP-1）活性中心的肽片段,通过RP-HPLC对粗肽进行纯化得到了高纯度的多肽,经电喷雾质谱、^1HNMR进行了表征.实验结果表明,Fmoc法合成粗肽的产率为76.0%,纯度为86.5%,经RP-HPLC纯化后纯度达到99.1%.     

直接黄11染料电渗析脱盐

采用电渗析法对直接黄11染料进行脱盐纯化,考察了电流密度、染料液室流量、染料质量浓度、盐的质量分数及pH值等对直接黄11染料电渗析脱盐过程的脱盐率与染料损失率的影响。实验表明,电渗析可有效脱除染料中的无机盐,在实验的电流密度1.5~5.0 mA/cm2、染料室流量0.12~0.21 L/min、染料质量浓度4~16 g/L、盐的质量分数5%~20%及pH3.8~12范围内,直接黄11染料液的脱盐率均达到99%以上,染料损失率小于2%。     

一种从菲律宾蛤仔黏附细菌Halomonas sp.GHF11中提取的多糖絮凝剂的表征其在脱色中的应用

从海洋细菌Halomonas sp. GHF11中纯化出一种新型微生物多糖。本研究首次报道了GHF11胞外多糖的絮凝和脱色活性。实验结果表明,该胞外多糖对高岭土的最大絮凝活性(FR)达到71.3%,去离子水系统中对燃料孔雀石绿的脱色活性达到92.4%。经过分离纯化后,发现该多糖为复杂的杂多糖,单糖组成分析其主要组分为摩尔比为4:1的葡萄糖和甘露糖,甲基化分析发现其糖苷键连接方式有葡萄糖1→2→3→4连接,甘露糖1→2→3→4→6连接。另外,对其絮凝活性进行表征发现,絮凝体系中多糖的用量明显较少,在500μg·L-1时达到最佳絮凝活性,对染料的脱色在1.8 mg·L-1时达到最佳效果。     

西瓜花叶病毒-2新疆株的纯化

研究了西瓜花叶病毒 2新疆株的纯化 .感病西葫芦叶组织在含有w =0 .2 %巯基乙醇和 0 .0 1mol·L- 1乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)的 0 .5mol·L- 1的磷酸钾缓冲液中匀浆 ,用匀浆体积 1/4的氯仿澄清 ,粗提取液中的病毒经含有 φ =1%TritonX 10 0和w =3%NaCl的w =6 %聚乙二醇沉淀 ,并以含有 0 .5mol·L- 1尿素、w =0 .1%的巯基乙醇和 0 .0 1mol·L- 1EDTA的 0 .5mol·L- 1磷酸钾缓冲液悬浮 ,后经含有w =0 .1%巯基乙醇和 0 .0 1mol·L- 1EDTA的w =10 %～ 4 0 %蔗糖密度梯度离心 ,获得了经电子显微镜、紫外检测和接种试验证实侵染活性为 94 .8%的纯化病毒 .纯化病毒的A2 6 0 /A2 80 =1.2 1,A2 6 0 /A2 4 5=1.15 ,纯化病毒产量约为每kg西葫芦感病叶组织中可提取 16mg .     

水溶性海参皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

从冻干仿刺参加工废弃液中分离纯化出水溶性海参皂苷，筛选并纯化出其强抗真菌活性组分，为利用水溶性海参皂苷研制高效抗真菌药物创造条件. 先后利用大孔树脂柱层析和硅胶柱层析对水溶性海参皂苷进行了纯化，并对各种纯化组分的抗真菌活性进行了测定. 在30%，50%，70%，80%，95%乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中，70%乙醇溶液洗脱组分对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抗真菌活性最强. 70%乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后，得到了SC-1、SC-2、SC-3和SC-4四种纯化样品，除SC-1无抗真菌活性外，其它3种纯化样品对裂殖酵母菌和白色念珠菌均具有显著的抗真菌活性，且组分SC-2和SC-3的抗真菌活性高于SC-4. SC-2纯化样品在高压液相柱层析（HPLC）图谱中仅显示为单一洗脱峰，且在旋转蒸发后可形成结晶，表明其纯度极高，可用于高效抗真菌药物的研制.     

大黄橐吾水溶性多糖的初步纯化及清除自由基活性研究

为合理利用大黄橐吾提供一定依据,对大黄橐吾多糖进行提取分离纯化.大黄橐吾经热水浸提,乙醇沉淀得到大黄橐吾粗多糖.粗多糖经凯氏定氮法测得蛋白质含量为14.02%,苯酚-硫酸法测得多糖中糖含量为23.41%,硫酸-咔唑法测半乳糖醛酸含量为35.16%.粗多糖经Sevage法和酶法联合脱蛋白,得初步纯化的多糖.纯化多糖经红外吸收光谱分析,初步断定其官能团的存在及其所处状态.对大黄橐吾多糖进行清除自由基活性研究,结果表明大黄橐吾多糖对超氧阴离子自由基和羟自由基具有明显的清除效果,且初步纯化后多糖的清除效果比粗多糖好.     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

盐酸改性粉煤灰吸附处理大红染料溶液研究

采用实验室制得的盐酸改性粉煤灰,以市售大红染料溶液为研究对象,研究了改性粉煤灰的类型、改性粉煤灰添加量、染料溶液的初始浓度、染料溶液的pH等对其吸附脱色效率的影响.结果表明:在50mL质量浓度为30mg/L的大红染料溶液中添加1g用2mol/L盐酸改性的粉煤灰,大红染料溶液pH值为2时,大红染料溶液被改性粉煤灰吸附脱色率可达到96.36%.     

人细胞色素P450氧化还原酶的克隆表达和抗体的制备

细胞色素P450还原酶(CPR)是人细胞色素P450酶系的电子供给者,对后者活性的发挥起到重要作用.本研究将从人胚胎cDNA文库中得到的人CPR的编码基因,连接入pT7450表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并纯化.每升发酵液可得到纯化蛋白49 mg,占总蛋白含量的10%,以细胞色素C为底物检测酶活性,比活为65 u/mg.利用纯化的CPR作为抗原,常规免疫纯系大耳家兔,获得高效价、高特异性的抗血清,抗体滴度为1∶200 000(ELISA法),纯化后抗体应用于不同组织中CPR含量的评价,证明重组CPR及其抗体可用于细胞色素P450的体外药物代谢及细胞色素P450与CPR作用机理的研究.     

植物血球凝集素-Sepharose 4B亲和层析纯化人绒毛膜促性腺激素

本文报道一种新的制备和纯化HCG的方法．人工流产物经45％乙醇抽提、调pH5．2～5．4后40～60％乙醇分级、植物血球凝集素-Sepharose4B柱层析纯化后,低温酒精沉淀干燥,可得到比效价3777.8IU／mg的hCG精品．     

中国棉铃虫核多角体病毒(Heliothis armigera NPV)VHA_(273)毒株血清学性质的研究

运用超速离心和Sepharose 2B或6B柱层析技术,纯化了中国棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)VHA273毒株的多角体、多角体蛋白和病毒粒子,并将其作为抗原免疫家免,在0.65%和1%的琼脂糖凝胶中进行了免疫双向扩散与免疫电泳。试验表明,VHA273毒株的多角体蛋白与病毒粒子虽然各自与其同源抗血清产生沉淀反应,但此二者之间并无血清学关系,试验还表明,VHA273毒株(mNPV)感染中国棉铃虫后产生了大量mNPV与少量sNPV,其多粒包埋与单粒包埋的多角体蛋白和病毒粒子,分别具有相同的抗原特性。由此初步认定,VHA273原毒种繁衍的mNPV与sNPV,在血清学性质上是相同的。     

栀子蓝色素的制备及其抗氧化活性研究

用米曲霉发酵产物水解栀子苷,水解产物与味精反应制备栀子蓝色素,采用DM-2大孔树脂对产品进行精制,通过DPPH·捕获分光光度法测定栀子蓝色素精制前后的抗氧化活性.栀子蓝制备的最佳条件为:10.64 g栀子苷和129.36 g水混合后,加入米曲霉发酵液9.8 m L,在50℃,160¹80 r/min下水解6 h后,与3.15 g味精反应40 h,80℃保温30 min.所获栀子蓝色素粗品的色价(E1%1cm)为90.56,经DM-2大孔树脂纯化后产品色价提高至180.01%,收率为90.96%.抗氧化实验表明栀子蓝色素粗品和精制品均能有效清除DPPH·,且精制后的栀子蓝色素产品清除DPPH·的能力增强.     

外源氨基酸对侧孢短芽孢杆菌S62-9产Brevilaterin的影响

为探究添加外源氨基酸对侧孢短芽孢杆菌S62-9(Brevibacillus laterosporus S62-9, BL)分泌抗菌肽Brevilaterin的影响,以BL发酵液的抗菌活性和Brevilaterin的组分变化为指标,分别采用琼脂扩散法和高效液相色谱法进行了分析。结果表明:添加L-缬氨酸、L-甲硫氨酸和2-氧代-3-甲基丁酸均能提高发酵液抗菌活性,抑菌直径最高可增加18.08%。添加外源氨基酸还能改变Brevilaterin的组分构成。添加L-甲硫氨酸后发酵液中只有抗菌肽组分Brevilaterin B和C,且二者间的相对比例发生反转;而添加L-缬氨酸或2-氧代-3-甲基丁酸还能促进BL分泌多种新组分。添加外源氨基酸能有效提高发酵液抗菌活性并改变抗菌肽的组分构成,研究结果旨在为人工调控微生物合成新型、高效的抗菌肽奠定一定的理论基础。     

高压电场中陶粒填充床对亚甲基兰的脱色效能

考察了高压脉冲电场中陶粒填充床对于亚甲基兰的脱色效能.实验结果表明,在高压脉冲电场与陶粒的相互作用下,亚甲基兰得到了有效去除.当反应条件为电压25 kV,通入空气流量为270 mL/min,亚甲基兰溶液初始质量浓度为5 mg/L,流速为40 mL/min,在反应180 min时,去除率稳定在78%左右.随着电压的增加,流速的减小,亚甲基兰初始质量浓度的减小和空气的通入,亚甲基兰的去除率都得到增加.在高压脉冲电场下,陶粒的存在增强了电场强度,同时放电过程也增强了陶粒对于亚甲基兰的吸附,二者的相互作用促进了亚甲基兰的降解.     

刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用

研究用交联琼脂糖为载体,三聚氯氰为活化剂,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基,制备亲和填料的方法.通过紫外和红外光谱分析,对制备的填料进行表征.用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r-PA),研究吸附与解吸附条件.结果表明,用该方法制备的亲和填料,制备工艺简单,吸附性能良好,对r-PA的吸附量为8.76 mg·g-1.解吸附完全,不影响活性,可以用来分离纯化r-PA.     

利用曲霉sp.HX-1发酵稻草秸秆制备纤维素酶

以稻草秸秆原料,利用曲霉sp.HX-1固态发酵生产纤维素酶,研究了不同发酵时间、不同氮源和氮源浓度对曲霉sp.HX-1纤维素酶系的影响,并最终用硫酸铵分级沉淀和低温冷冻干燥的方法得到混合纤维素酶干品.结果表明,发酵6 d后稻草秸秆产生的纤维素酶活力单位最大,分别为CMC酶307 U/mL,C1酶841 U/mL、β-葡萄糖苷酶205 U/mL.以不同氮源优化发酵条件时发现,NH4NO3质量浓度为1 g/L时CMC酶活力达到1 652 U/mL,且失重率也到达最大值17.42%;NH4Cl质量浓度为0.5 g/L时,C1酶活力达到1 807 U/mL;尿素（UREA）质量浓度为2.0 g/L时,β-葡萄糖苷酶活力为2 033 U/mL,这表明氮源对曲霉sp.HX-1纤维素酶系的影响很大.最后在NH4NO3质量浓度为1.0 g/L的条件下,将120 g稻草秸秆发酵6 d,从发酵液中提取得到8.851 7 g混合纤维素酶的干品.此实验为以后探讨碳源或者其他因素的影响提供方法借鉴,也可以为获得纤维素酶混合酶干品的获得提供参考方法.     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

东方伊萨酵母降解木糖醇发酵抑制物研究

选择存在于半纤维素水解物中6种主要微生物代谢抑制物,用HPLC-DAD建立检测方法,分析东方伊萨酵母对这些抑制物的降解活性、代谢途径,以及生物脱毒处理对热带假丝酵母木糖醇发酵性能的影响。结果表明,东方伊萨酵母能直接利用醋酸,将芳香醛还原为相应的醇,含有裂解芳香环,最终将其彻底降解的复杂酶系。东方伊萨酵母对抑制物:醋酸4000mg·mL-1、糠醛400mg·mL-1、香草醛90mg·mL-1、对羟基苯甲酸40mg·mL-1、阿魏酸100mg·mL-1和愈创木酚30mg·mL-1脱毒发酵80h的降解率分别为100%,100%,100%,14.3%、65.8%、78.6%,木糖醇发酵性能得到显著改善。经生物脱毒处理之后的醋酸、糠醛、愈创木酚、阿魏酸培养基,再用热带假丝酵母进行木糖醇发酵的产物生成速率(木糖醇g.L-1.h-1)分别为2.67,2.66,2.72,2.66,基本达到了商品木糖培养基的木糖醇生成速率水平(2.79)。