利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库

以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库。从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA,合成双链cDNA;cDNA经BP重组反应重组到入门载体pDONR222上,构建得到天山雪莲en-try cDNA文库;天山雪莲entry cDNA再经LR重组反应将雪莲cDNA重组到植物表达载体pLEELA上,从而构建了天山雪莲cDNA表达文库。结果表明:cDNA入门文库滴度达到1.2×107cfu/mL,文库总容量为4.8×107cfu。表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107cfu,插入片段平均大小1000 bp。阳性克隆率100%。天山雪莲cDNA表达文库的建立为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础。     

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.     

小麦苗期盐胁迫72h cDNA文库的构建及质量检测

以98-160盐胁迫72 h叶片的mRNA为起始材料,采用SMART技术构建了一个高质量的cDNA文库,经检测,未扩增文库的滴度为3.44 ×106 pfu/mL,白斑率＞85%,插入片段多数在0.5～1.5kb,有的可以达到2kb,平均长度为800bp.因此,按照此方法构建的是1个高质量的cDNA文库,可有效地用于下一步全长基因的筛选和克隆.     

中华卵索线虫cDNA文库的构建

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种宝贵的昆虫天敌,宿主广泛,其寄生率即等于宿主的死亡率,生防潜力极大.鉴于cDNA文库在保存稀有物种基因资源与目的基因筛选及其功能研究等方面的优势,实验以中华卵索线虫为材料,采用SMART技术构建其cDNA文库.实验结果表明：滴度为1.16×109 cfu·mL－1,包含6.0×106个克隆.从原始文库中随机挑16个单菌落过夜培养,提取质粒,经XhoⅠ和 PstⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳结果表明插入片段大小主要集中在0.5～2.0 kb之间,文库重组率接近100%.文库的各项指标均达要求,可用于全长cDNA的筛选,为新基因的获得及其结构功能研究提供了可靠材料,也为今后的生物防治等研究奠定了基础.     

海鲈头肾cDNA文库的构建

本文以海鲈头肾组织为材料,分离出mRNA,合成cDNA双链后,收集500-4000bpcDNA片段,构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的滴度为7×105pfu,随机挑选噬菌斑的插入片断在500~2000bp之间,证明建立的文库中所包含的重组cDNA分子种类具有一定的完整性,可作为海鲈头肾基因的重要资源。     

堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及鉴定

构建堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)孢子化卵囊cDNA表达文库,以筛选其功能性基因.用TRI-ZOL Reagent试剂提取堆形艾美耳球虫总RNA,再用Oligo(dT)12-纤维素柱从总RNA中分离mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR法反转录合成cDNA第一链,用LD-PCR法扩增合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体按一定比例连接,经体外包装,建立堆形艾美耳球虫孢子化卵囊的噬菌体表达文库.随后测定文库容量为4.6×106pfu/mL,扩增文库的滴度为4.4×1010pfu/mL,重组率达到98%,插入片段大小为750~1 000 bp,并从扩增文库中扩增出了堆形艾美耳球虫巨噬细胞游走抑制因子基因片段.     

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.     

水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析

为了克隆水稻第6染色体上S5位点的基因及包括广亲和基因在内的重要功能基因,以水稻Oryza sativa L.广亲和品种Cpslo17为材料,以λTriplex2TM为载体利用SMART技术构建了幼叶和幼穗2种器官的cDNA噬菌体文库.幼叶和幼穗原始文库的克隆数目为别为1.5×105 pfu和2.45×105 pfu,插入片段的大小均在500～3 000 bp之间,文库的阳性克隆子的为别比例为97.0%和98.7%.此文库的建立为克隆广亲和基因和其它重要全长功能基因奠定了基础.     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因,运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA,mRNA逆转录后合成cDNA,经均一化处理后,SfiⅠ酶切,连接质粒载体,电转化,成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL,其重组率高达94%,插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

枝状枝孢霉MD2的候选基因A00981的克隆及转基因菌株的构建

目的:为揭示真菌紫杉醇合成分子机制.方法:克隆了产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的候选基因A00981,该基因DNA和cDNA序列分别为969 bp和894 bp;其编码蛋白含有298个氨基酸、无跨膜结构和信号肽,与酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)具有73%的一致性.进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A00981,并转化枝状枝孢霉MD2,共获得9株转基因菌株.结果:Southern blot分析证明其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式插入.结论:该结果为深入分析超表达候选基因A00981对枝状枝孢霉MD2紫杉烷类合成的影响奠定了基础.     

香雪兰花瓣总RNA的提取和cDNA文库的构建

以不同开放时间的红色香雪兰的花瓣为材料,利用CTAB裂解、LiCl沉淀的方法提取出高质量的总RNA,经纯化mRNA后,合成双链cDNA,加上EcoRⅠ和XhoⅠ接头,用胶回收的方法将500 bp以上的cDNA回收并连在载体上,获得了重组率为89%,滴度为4.8×105pfu/mL的香雪兰花瓣质粒cDNA文库,为研究香雪兰花香和花色的相关基因奠定了基础.     

匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶培养基优化研究

利用响应面法对匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶的培养基进行优化研究.采用单因素实验,得到最佳的碳源、氮源、无机盐.采用Plackett-Burman对影响匍枝根霉产木聚糖酶发酵的相关因素进行评价,确定有显著效应的3个因素.采用最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行培养基优化.结果表明,培养基组成:3.9%麦麸玉米芯粉混合碳源,0.35%(NH4)2SO4,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4·7H2O,0.4%CaCl2,0.06%吐温-80,1%微量元素液,装液量为100mL,pH自然,接种量为10%,在30℃,180r/min条件下培养,其木聚糖酶酶活达到最高为101.697U/mL,比优化前木聚糖酶酶活提高了3.5倍.     

烟草腺毛全长cDNA文库的构建

冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol法提取总RNA,采用SMART技术构建了烟草腺毛的全长cDNA文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pfu/mL,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800~1 000 bp之间,将测得的序列进行Unigene归并和序列全长分析,得到了23条Unigene,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建与鉴定

利用λZAPExpress载体成功地构建了中国猪株旋毛虫分离株Trichinellaspiralis新生幼虫的cDNA文库 ,并对其重组噬菌体质粒pBK—CMV进行酶切鉴定 .结果表明 :所构建的cDNA文库容量为 1 92× 10 6,重组效率为 98 6 % ,所有的克隆片段都在 0 5— 2 0Kb之间 ,说明此cDNA文库几乎覆盖了全部mRNA .     

中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选中国美利奴羊与免疫反应相关的的功能基因并研究这些基因的功能,构建了以美利奴羊外周免疫器官的cDNA文库。通过提取总RNA,分离纯化mRNA并以其为模版参照ZAP Express cDNA Synthesis Kit说明书构建cDNA文库。结果表明:该文库初级库容达到了3.28×105pfu,扩增库滴度为3.8×108pfu/mL,重组率为97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之间,平均大小为1.5 kb。该文库的成功构建为后续研究奠定了分子基础。