抗冻蛋白-GUS基因诱导性融合表达载体转化烟草植株中GUS活性测定

把修饰合成的带有甘薯信号肽序列的抗冻蛋白成串基因与β-葡萄糖醛酸苷酶(GU S)报道基因融合克隆在大豆热休克启动区下游构建了温度诱导型双元载体pBF 04,三亲株配对法转化根癌农杆菌,叶盘法导入烟草,获得了转基因烟草植株.将10株转基因烟草放置在40℃诱导不同时间,利用荧光光度分析法测定水解液中GU S活性,结果诱导18、24、48小时的4株中GU S活性明显高于对照组和诱导6、12小时组,说明我们修饰合成的抗冻蛋白与GU S基因融合构建的载体在热休克启动区控制下可以诱导表达.经组织化学法测定这些阳性植株的叶片和茎段切片细胞间隙显示GU S活性,提示甘薯信号肽可能起作用.     

重组β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的定向性改造

为提高重组β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性,通过易错PCR方法对其进行突变并构建突变体文库,利用薄层层析和高效液相色谱对突变文库进行筛选,获得了突变株PGUS（M51）E,其底物特异性提高了41％。突变酶的酶学特性研究发现,该突变酶的最适pH值和温度较PGUS-E无显著变化,酶活力下降了16．86％,T。值提高了5℃;序列分析结果表明：PGUS（M51）-E共发生5处突变,其中3处发生在糖基结合域。因此,利用定向进化策略能有效提高伊葡萄糖醛酸苷酶的底物识别特异性。     

过度训练状态下大鼠心肌线粒体内钙和MDA、心肌ACP和β-葡萄糖醛酸酶变化的动态观察

为了研究过度训练状态下心肌组织损伤的变化规律,采用建立一般训练和过度训练大鼠模型,应用形态学手段和分子生化技术,对训练后两组大鼠心肌线粒体内钙含量、脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、超氧化物歧化酶(SOD)、心肌组织匀浆内酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)和β葡萄糖醛酸酶(Beta-glucuronidase)做了定位和定量研究.结果表明,第4周末,一般训练组和过度训练组大鼠心肌线粒体内钙含量、MDA和GSH-px、SOD活性和心肌ACP、β-葡萄糖醛酸酶的活性未见异常改变(P＞0.05).但是第8周末,过度训练组心肌线粒体内钙和MDA含量明显升高,GSH含量和SOD活性明显降低;心肌ACP和β葡萄糖醛酸酶明显增加.结果提示过度训练后心肌细胞发生了病理性变化,这些变化可能与线粒体内钙积聚和自由基损伤有关.     

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.     

PF6/缓冲液两相体系中固定化 β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.     

半育耳蕨化学成分及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

采用MCI柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和半制备HPLC等色谱分离手段对半育耳蕨的化学成分进行研究.利用理化性质及波谱数据(MS、NMR)对其结构进行鉴定,从半育耳蕨体积分数95%的乙醇提取物中分离并鉴定了10个化合物,分别是2R, 3R-3, 5, 6, 7, 8,4′-hexahydroxyflavane(1)、(-)-表儿茶素(2)、(+)-epicatechin(3)、arachniodesin A(4)、4β-carboxymethyl-(-)-epicatechin methyl ester(5)、eriodictyol(6)、daucosterol(7)、3, 4-二羟基苯甲酸乙酯(8)、圣草酚7-O-β-D-(6′-甲酯基)-吡喃葡萄糖醛酸苷(9)、圣草酚7-O-β-D-(6′-乙酯基)-吡喃葡萄糖醛酸苷(10).化合物1～10均为首次从耳蕨属中分离得到.活性测试结果表明,化合物4、5和6对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性,其IC_(50)分别为(26.2±1.9)、(32.6±2.5)和(51.5±3.5)μmol·L~(-1).     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究

在活性炭、明胶等8种固定化载体筛选的基础上研究了以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂固定化β-葡萄糖苷酶的条件,并对固定化酶的酶学性质及其在催化制备大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用进行了研究。β-葡萄糖苷酶在0.20%戊二醛溶液中交联2 h后再与20 g/L海藻酸钠混合,然后逐滴加到4 g/LCaCl2溶液中,固化1 h后过滤、洗涤得固定化β-葡萄糖苷酶,固定化酶的酶活回收率为83.67%。固定化酶的最适温度、热稳定性、pH值稳定性以及与底物的亲和力都有所提高,最适pH值基本不变。该固定化酶重复使用6次后其活力仍保持90.94%,染料木苷转化率达60.02%。     

秦岭中草药黄芩中黄酮类化合物的分离及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

目的分离鉴定秦岭中草药黄芩中的黄酮类物质并研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法植物原料用溶剂提取,常压硅胶柱色谱及制备液相色谱分离,高分辨质谱及核磁共振波谱分析确定化合物分子结构,PNPG法测定化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果分离鉴定了8种黄酮类化合物,分别是汉黄芩素(1)、黄芩素(2)、汉黄芩苷(3)、千层纸素A-7-O-葡萄糖酸苷(4)、白杨素-7-O-葡萄糖酸苷(5)、黄芩苷(6)、黄芩素-6-O-葡萄糖酸苷(7)和去甲汉黄芩素-8-O-葡萄糖酸苷(8),活性实验表明化合物1和7表现出较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性,其IC_(50)分别为0.13mmol/L和0.25mmol/L,稍强于阳性对照阿卡波糖(IC_(50):0.42mmol/L)。结论秦岭中草药黄芩中某些黄酮类物质能够有效抑制α-葡萄糖苷酶,具有与阿卡波糖相当的降糖作用。     

秦岭中草药黄芩中黄酮类化合物的分离

目的 分离鉴定秦岭中草药黄芩中的黄酮类物质并研究其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性.方法 植物原料用溶剂提取,常压硅胶柱色谱及制备液相色谱分离,高分辨质谱及核磁共振波谱分析确定化合物分子结构,PNPG法测定化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性.结果 分离鉴定了8种黄酮类化合物,分别是汉黄芩素(1)、黄芩素(2)、汉黄芩苷(3)、千层纸素A-7-O-葡萄糖酸苷(4)、白杨素-7-O-葡萄糖酸苷(5)、黄芩苷(6)、黄芩素-6-O-葡萄糖酸苷(7)和去甲汉黄芩素-8-O-葡萄糖酸苷(8),活性实验表明化合物1和7表现出较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性,其IC50分别为0.13 mmol/L和0.25 mmol/L,稍强于阳性对照阿卡波糖(IC50:0.42 mmol/L).结论 秦岭中草药黄芩中某些黄酮类物质能够有效抑制α-葡萄糖苷酶,具有与阿卡波糖相当的降糖作用.     

里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

系列木聚糖降解酶基因同向串连表达的研究

采用分子克隆操作方法,通过设计多个SD序列的多克隆位点,首次成功构建了一个木聚糖降解酶系列基因同向串连表达载体,经筛选鉴定获得具有极耐热性的α-阿拉伯呋喃糖苷酶基因（XarB）、葡萄糖醛酸酶基冈（αguA）和木聚精酶基因（龄nB）同向串连的pHsh／XarB-aguA-XynB一株克隆菌,酶学分析表明重组菌株具有较好的阿拉伯糖苷酶、木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶和木聚糖酶活性．酶活单位分别为：阿拉伯糖苷酶11．8U／mL,β-木糖苷酶6．87U／mL,α-葡萄糖醛酸酶1．53U／mL,木聚糖酶6．58U／mL．     

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选, 从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16SrDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829. 综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果, 将其鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）2-37-4-1. 确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18?h;碳源实验证明,该菌株β 半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响, 确定最适反应条件为pH7.5、50mmol/L（磷酸缓冲液）配制的40%乳糖溶液, 55℃反应24h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%, 双糖（包括乳糖和转移二糖）33.02%, 葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.     

葡萄糖醛酸轭合反应及其在药物代谢转化中的作用

 综述了葡萄糖醛酸轭合反应在药物代谢转化中的作用研究进展。论述了催化药物葡萄糖醛酸轭合反应的葡萄糖醛酸转移酶(UDP-Glucuronosyltransferases, UGTs)的分布、分类及其底物多样性,药物葡萄糖醛酸轭合反应的产物类型,药物葡萄糖醛酸轭合反应的毒理药理效应等;阐述了药物代谢中的去葡萄糖醛酸轭合反应的风险和意义,脑部葡萄糖醛酸转移酶的分布活性及功能,葡萄糖醛酸轭合产物的分析方法,葡萄糖醛酸轭合反应过程的个体差异、种间差异等。研究表明,葡萄糖醛酸轭合反应是重要的药物清除与代谢反应,与药物代谢、药效、毒副作用及癌症的发生等关系密切。     

川黄柏的抗肿瘤化学成分研究

应用现代方法对川黄柏中化学成分及其体外抗肿瘤作用进行研究.从川黄柏中分离鉴定了7个已知化合物,分别为小檗碱(1)、巴马汀(2)、10,11-二甲氧基-13-甲基小檗碱(3)、丁香脂素O-β-D葡萄糖苷(4)、紫丁香酚苷(5)及常见的β-谷甾醇(6)和β-胡萝卜苷(7).以HepG2、MCF7、HT29和MKN28肿瘤细胞株为研究对象,采用MTT法研究了化合物的体外抗肿瘤活性.实验结果显示化合物1和3具有较强的抑制肿瘤细胞HepG2生长的作用,IC50值分别为0.15和0.19μM.表明川黄柏中得到的化合物对不同种肿瘤细胞具有细胞毒选择性,有一定的抗癌活性.     

超高效液相色谱-质谱法同时测定肉制品中8种β-受体激动剂

目的建立动物源性食品中8种β-受体激动剂的LC-MS/MS检测方法。方法使用乙酸-乙酸铵溶液调节pH为5.2,β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶提取,经固相萃取柱净化、浓缩、定容后采用LC-MS/MS进行分析。结果 5~100ng/mL浓度范围有良好的线性关系,各组分相关系数r0.998,加标回收率范围75%~94%。结论该方法灵敏度高、准确、重现性好,适用于肉制品中β-受体激动剂的残留量检测。     

耐热β-半乳糖苷酶(Pyrococcus furiosus DSM 3638)活性位点N415S点突变对其酶活性的影响

β-半乳糖苷酶具有将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的能力,也具有把半乳糖聚合成低聚半乳糖的能力。这两种能力在工业生产中具有不同的意义。通过点突变使β-galactosidase[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突变为丝氨酸(Ser or S),突变体构建于毕赤酵母表达质粒载体,并筛选以毕赤酵母为宿主细胞的工程菌种,以此制备β-半乳糖苷酶的突变体酶蛋白。研究发现,该突变体的β-半乳糖苷酶活性在95℃、p H5.5时达到最高酶活,为耐高温乳糖酶,且该突变体水解牛奶的能力较好,可用于低乳糖牛奶及其相关制品加工中。而突变后β-半乳糖苷酶的另一个活性,即产生低聚半乳糖的能力的活性也有所提高,但不够明显。因此该位点突变可用于乳制品的加工,但不能期盼产生更多的半乳糖寡聚体。     

水稻土壤宏基因组中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及酶活的研究

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族3,它能够水解非还原性末端的β-D葡萄糖苷键,释放出游离的葡萄糖及相应的配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素降解中的关键酶,对于可再生资源纤维素的利用具有十分重要的意义。本研究从水稻土壤中分离得到β-葡萄糖苷酶基因pds5,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,转化BL21大肠杆菌中,并诱导表达该基因。重组BL21大肠杆菌用IPTG诱导后,所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为83 kD。通过控制pH和温度的方法,测得该酶酶活最适pH为7.0,最适温度为37.5℃。     

右旋甲状腺素对Ⅱ相代谢酶UGT2B17抑制的研究

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)主要参与体内多种物质代谢,是人体内最重要的Ⅱ相代谢酶. UGT2B17是UGTs的一种亚型,当UGT2B17的活性被抑制,其代谢的多种内源性和外源性物质在体内蓄积,产生相应的毒副作用.本实验建立经典的体外孵育体系,采用4-甲基伞形酮(4-MU)作为反应底物,测得右旋甲状腺素存在的情况下,UGT2B17对4-MU代谢的残余活性小于20%,后续实验测得抑制动力学参数Ki值为0.064 μmol/L.所以右旋甲状腺素对UGT2B17的活性有强烈的抑制作用.因此在临床中应用含右旋甲状腺素的药物时应注意其剂量,避免引起其对UGT2B17活性的抑制,导致毒副作用.     

酸性木聚糖酶产生菌XYW5的筛选及酶学性质

【目的】选育优良的产酸性木聚糖酶的微生物,考察酸性木聚糖酶的酶学性质(尤其是pH值为4.0),为实现纤维素乙醇低成本清洁生产打下基础。【方法】从广西大学农场采集土壤,富集后经产酸性木聚糖酶的培养,比较酸性木聚糖酶酶活力,选育酸性木聚糖酶高产菌株,鉴定菌种,分析酶学性质。【结果】筛选出产酸性木聚糖酶酶活力较高的菌株XYW5。扩增菌株XYW5的ITS rDNA序列,经测序分析比对,将其初步鉴定为日本曲霉Aspergillus japonicus XYW5。菌株XYW5产酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(26. 26±0. 97)U/mL和(0.63±0.02) U/mL,比活力分别为(85.50±0.63) U/mg和(1.80±0.01) U/mg;其酸性木聚糖酶最适温度和最适pH值分别为65℃和6.5,酸性木糖苷酶最适温度和最适pH值分别为70℃和4.5;酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,达到8.54 U/mL。【结论】菌株XYW5所产的酸性木聚糖酶具有开发成为优良工业酸性木聚糖酶的潜力。     

密脉鹅掌柴的化学成分研究(Ⅱ)

 对密脉鹅掌柴进行了化学成分研究.采用硅胶柱色谱、Pharmadex LH-20柱色谱、RP-C₈柱色谱等方法分离化学成分,应用UV,IR,MS,NMR,2D-NMR等方法进行结构分析,从中分离鉴定了2个新的齐墩果酸型三萜皂苷:3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)--β-D-吡喃葡萄糖醛酸基齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(1)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)--β-D-吡喃葡萄糖醛酸基齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基酯苷(2).