全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间充质样干细胞(m esenchym al-like stem cell,MSCs),探索其体外培养的生物学特性。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓间充质样干细胞;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化,并利用特异性细胞化学染色法加以鉴定。结果:从人胎骨髓中成功分离、纯化得到间充质样干细胞,P4代细胞有92.3%的细胞处于G0/G1期;P5代细胞有96.1%的细胞处于G0/G1期;流式细胞仪检测P3代细胞结果显示:人胎骨髓MSC表达CD15、CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下,人胎骨髓MSCs可迅速向脂肪及成骨方向分化。结论:人胎骨髓中含有丰富的间充质样干细胞,具有较强的多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程的较为理想的种子细胞。     

人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究

为进一步研究脂肪组织来源的干细胞增殖和多向分化潜能,用改进的方法分离脂肪组织来源的干细胞,通过cck-8检测细胞的增殖能力、流式细胞仪检测干细胞相关表面标记的表达、RT-PCR对干细胞相关基因的表达进行分析;并对分离得到的细胞向脂肪、软骨、骨及心肌细胞诱导,观察其多向分化能力.结果显示:采用改进的方法,从400～600 mg脂肪组织可收获约5×105个脂肪组织来源的干细胞,并且细胞可以重叠生长1个月以上,期间细胞表现出几个对数增殖期;所有增殖的细胞其干细胞相关表面标记都呈阳性表达;转录因子Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1也呈强阳性表达;ADSCs向脂肪、骨、软骨和心肌细胞诱导分化后能够分别表达脂滴、碱性磷酸酶和矿化结节、富含黏多糖的软骨细胞外基质,以及少量心肌特异性连接蛋白Connexin-43,表明ADSCs具有向多个胚层细胞分化的能力.此外,为获得更多具有强增殖能力的细胞,根据生长曲线,对细胞进行每14 d传代而非传统的5 d传代,发现所得到的细胞仍保持强的增殖能力、干细胞表型以及更强的多向分化潜能.     

骨髓间充质干细胞研究进展

干细胞移植是目前治疗器官损伤、神经退行性疾病研究的热点,国内外学者分别对神经干细胞、胚胎干细胞等进行了探索,渴望从中找出细胞移植领域的候选细胞,但是这些细胞大多面临着伦理、来源、免疫排斥等多方面的问题.然而,近年来发现的骨髓间充质干细胞在一定程度上弥补了这一不足.骨髓间充质干细胞凭借其多向分化潜能、强大的自我复制能力和可移植性,成为细胞移植、基因治疗中重要的候选细胞.骨髓间充质干细胞移植为器官损伤、神经退行性疾病的临床治疗带来了新的希望,本文对其生物学特性及临床应用方面做一综述.     

人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,在体外不仅可以分化为间充质类细胞,而且可以分化为非间充质类细胞.研究了人骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件.从骨髓中分离MSC,用MesenCult培养基进行纯化和扩增培养.每扩增一代,细胞数量增加约2～3倍,在体外扩增12代后扩增约4.6×10 4 倍;诱导不同扩增代数的MSC向神经细胞分化,诱导后的细胞平均有80%以上呈现典型的神经元样表型.免疫组化法检测发现,神经元样细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶,组织化学法检测观察到神经元特有结构尼氏体,表明MSC在体外具有向神经细胞分化的潜能.     

小鼠胎肝间充质干细胞体内向骨骼肌样细胞分化的研究

目的:了解小鼠胎肝间充质干细胞在体内向骨骼肌细胞分化的潜能。方法:无菌条件下将C57BL/6 J胎鼠肝脏制成单细胞悬液,雄性胎肝悬液体外贴壁培养纯化,传3代后将贴壁细胞移植于心肌毒素(card iotoxin)造成的雌鼠骨骼肌损伤部位,2月后处死受鼠,取相应骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝间充质干细胞向骨骼肌样细胞分化情况。结果:在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为desm in /F lt-1-/CD4-5/F4-/80。结论:胎肝中分离出的间充质干细胞在体内可以分化为骨骼肌样细胞。     

体外分离培养的心脏干细胞具有间充质干细胞的特性

近年来,已报道从成年的小鼠中分离得到心脏干细胞(Cardiac Stem.Cells CSCs),并且应用于心脏病的治疗.但是心脏干细胞特征尚未完全阐述.通过体外分离成年小鼠的心肌组织,进行培养,分离得到半悬浮状态的具有干细胞特性的细胞;利用流式细胞仪检测分离得到的心脏干细胞的表面分子表达情况;并且通过调整培养条件诱导其体外分化.研究结果显示成功分离得到的心脏干细胞,表达干细胞标志分子Sca-1,以及间充质干细胞标志分子(CD29、CD90、CD44和CD106);体外分化研究显示心脏干细胞可以分化成心肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和成骨细胞.心脏干细胞具有间充质干细胞的特性,具有多向分化潜能,在心脏损伤的治疗中具有重要意义.     

骨髓间充质干细胞三维培养--构建工程组织

骨髓间充质干细胞因其可获得性、可扩增性和可多向分化性,是理想的组织工程种子细胞,用于构建工程组织。实现这一目标的主要障碍在于如何在体外模拟生理环境培养骨髓间充质干细胞,因此,研究并改进骨髓间充质干细胞体外三维培养至关重要。对近年来骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞的培养方式、培养系统以及培养中的环境因素加以评述。     

骨髓间充质干细胞体内分布及其分子机制

骨髓间充质干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在组织修复和基因治疗上有广泛的应用前景。近来研究认为进入循环中的骨髓间充质干细胞可以迁延到广泛的组织，当组织损伤时，还可以特异性迁延到靶组织参与修复。影响骨髓间充质干细胞迁延的机制是近年研究的热点。本文就骨髓间充质干细胞体内分布及其相关分子机制的研究予以综述。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及分化潜能鉴定

用全骨髓贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)。为鉴定其成骨分化潜能,将大鼠BM-MSCs进行成骨诱导培养,第7天用碱性磷酸酶染色显示有碱性磷酸酶阳性细胞,第21天进行茜素红染色有矿化骨节形成。为鉴定其成脂分化潜能,将大鼠BM-MSCs先在成脂诱导培养基中培养,再换为在成脂肪维持培养基中培养,第10天进行油红O染色有脂滴形成。表明从SD大鼠骨髓中成功分离得到具有多向分化潜能的大鼠BM-MSCs,为其作为种子细胞应用于临床或研究奠定基础。     

生物力学作用对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化影响研究进展

骨髓间充质干细胞在体内所处的力学环境比较复杂,为了探索生物力学与骨髓间充质干细胞增殖分化之间的关系,对近年来生物力学微环境对骨髓间充质干细胞增殖分化影响的研究现状和最新进展进行了综述。认为牵张力与流体剪切力对骨髓间充质干细胞产生的刺激大部分会使其向成骨方向分化,而较大的压缩力和静水压力对骨髓间充质干细胞产生的刺激大部分会使其偏向软骨方向分化,小部分向成骨方向分化,每种分化方向都有其最适的分化条件。通过综述生物力学对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响,为骨髓间充质干细胞的骨组织工程与再生医学研究及更好地应用于临床治疗提供思路和参考依据。     

蒙古羊脂肪来源间充质干细胞的分离培养及体外分化诱导

建立蒙古羊脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem ceils,ADSCs）体外分离培养方法,并对其生物学特性和多向分化潜能进行鉴定。利用I型胶原酶将蒙古羊脂肪组织消化后,离心得到单核细胞,并进行传代培养,测定其倍增时间。采用甲苯胺蓝染色和PAS染色法以及RT-PCR法,分别从组织学水平和基因水平对第3代蒙古羊ADSCs向成神经和成心肌的诱导分化情况进行鉴定。结果显示,分离得到的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样;传代接种后第4天细胞进入指数生长期,第8天进入平台期,前10代ADSCs的倍增时间平均为34．1h;经成神经诱导后,细胞呈胶质细胞状,RT-PCR检测EN02和GFAP基因表达呈阳性;心肌诱导后,细胞体积增大,多呈长梭形,平行排列,诱导15d后部分细胞可见类肌管样结构,PAS染色可见明显的糖原沉积,RT-PCR检测NKX2．5和GATA-4基因表达呈阳性。表明获得的蒙古羊ADSCs具有多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

神经元素3蛋白(Ngn3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素表达细胞分化的初步研究

胰腺发育相关基因神经元素3（neurogenin3,Ngn3）,属于碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）家族的转录因子,对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要,且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质．之前的研究发现,全长Ngn3蛋白具有蛋白质转导功能,可以高效进入多种真核细胞系．近年来多项研究显示,骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞．利用蛋白质转导技术,将体外表达纯化的胰腺发育重要因子Ngn3蛋白导人体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞中,诱导其向胰岛素表达细胞分化．结果显示,经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象,并有形状类似胰岛的细胞团出现．RT-PCR结果显示经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞可以有效表达胰岛素,并且一些β细胞相关基因如胰十二指肠同源盒基因-1（pancreatic-duodenal homeoboxl,Pdx-1）,神经分化因子（neurogenic differentiation,NeuroD）,同源结构域基因4（pairedboxgene4,Pax4）,葡萄糖转运体-2（gluoase transporter2,Glut-2）都有表达．细胞免疫荧光也可检测到胰岛素的表达．通过Ngn3蛋白质诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞的初步研究,探索了应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得胰岛素表达细胞的可行性,为糖尿病治疗提供一定的实验依据．     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.     

猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导

脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．     

围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术及应用

间充质干细胞(MSC)是来源于中胚层的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。系统地研究了P-MSC与骨髓MSC生物学特性和功能的异同,建立的围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术体系,为推动我国乃至国际干细胞药物的开发以及干细胞产业的发展起到积极的作用。     

人足月胎盘间充质干细胞的分离纯化及其特征

目的:从人足月胎盘中分离、培养间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特征.方法:将人足月胎盘组织经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法获取间充质干细胞,运用活细胞计数和碘化丙啶(PI)检测其增殖能力;采用流式细胞术检测其细胞表面标志的表达;用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用Yon Kos-sa染色进行鉴定;用地塞米松与胰岛素诱导其向脂肪细胞分化,并以油红O染色进行鉴定.结果:从人足月胎盘分离的间充质干细胞为梭形贴壁细胞,增殖能力较强;强表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR;经诱导后向脂肪细胞及成骨细胞分化,油红O染色、Von Kossa染色为阳性.结论:人足月胎盘中也富含间充质干细胞,与其他来源的间充质干细胞的生物学特征相似,可能是组织工程新的干细胞来源.     

骨髓间充质干细胞向心肌分化的研究进展

目的:介绍骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展.方法:综合分析近年来国内外相关文献资料.结果:骨髓间充质干细胞在体内、外均可分化为心肌细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料.     

hESC衍生和组织源MSC标记GFP基因的特性分析

干细胞标记示踪在研究细胞治疗机理中具有重要作用,而标记物对干细胞的安全可靠性是细胞标记示踪的重要前提。文章对人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞（hESC-MSC）、人脂肪间充质干细胞（hADSC）和人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）进行了绿色荧光蛋白（GFP）基因慢病毒转导并比较它们在转导前后的增殖、多项分化潜能和细胞表型等生物学特性以及它们的转导效率。结果表明,在等量pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体转导下,hESC-MSC细胞慢病毒转导效率显著高于h ADSC(P<0.01)和hUC-MSC(P<0.01);但是hESC-MSC、hADSC和h UC-MSC标记GFP基因前后细胞增长形态、增殖力、细胞表面抗原的表达和分化潜能均没有明显差异。文章提示不同来源的间充质干细胞均可进行安全可靠的GFP基因标记,而人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞可能更适合用以慢病毒感染的示踪标记或者基因修饰。