结核分枝杆菌H37Rv组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增hisD基因,构建pET-28a-HDH重组质粒;转化重组质粒到E.coli BL21(DE3)并诱导表达,纯化可溶性的结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶(HDH),并对其性质进行研究,结果表明:重组结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶能以L-组氨醇和NAD 为底物催化L-组氨醇生成L-组氨酸;该酶的最适pH值为8.3,最适温度为45℃,比活力为1.788 U/mg;Mn2 ,Ca2 ,Zn2 ,Co2 等对酶促反应有激活作用;底物NAD 和L-组氨醇的米氏常数分别为0.9765 mmol/L和2.755μmol/L;25℃时重组蛋白的二级结构中有20.5%的α-螺旋,40.9%β-折叠,4.2%β-转角,34.3%无规卷曲.     

结核分枝杆菌Rv1009基因的克隆、表达及亲和层析纯化

克隆表达结核分枝杆菌Rv1009基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用聚合酶链反应（PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增了Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入到pGEM—Teasv中,序列测定正确后．再亚克隆到融合表达载体pPro—EX HT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv1009蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009蛋白基因．得到融合6个组氨酸残基的Rv1009蛋白纯度大于80％。证实构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白．为以后的深入研究奠定了基础．     

功能模块的集成与测试研究

谷氨酸棒杆菌作为棒杆菌中的模式生物,拥有多条完整的芳香化合物代谢途径,全基因组测序的完成为在谷氨酸棒杆菌中进行代谢调控研究提供了良好的生物信息学平台;该菌包括基因敲除及互补在内的遗传操作系统非常成熟,是研究芳香化合物代谢调控机制的良好模型。该研究旨在利用棒杆菌等模式生物中的莽草酸合成及芳香化合物代谢相关元件进行元件适配性研究,同时结合生物信息学、分子生物学及生物化学方法发掘其他微生物中这两类元件,并对元件进行表征、改造及标准化并建立元件库;选取高效能的功能元件拼接组装为功能模块,并在棒杆菌等底盘细胞中进行检测适配性,从而构建出高效合成以莽草酸为代表性芳香化合物的人工细胞。到目前为止,研究工作完成了谷氨酸棒杆菌莽草酸合成途径酶元件的鉴定,重点完成了谷棒DAHP合酶和分支酸异构酶功能表征及元件间适配性关系,获得大量潜在的莽草酸合成相关代谢元件;并对部分代谢元件进行功能验证和表征;同时建立高效蛋白表达及酶活测定体系。鉴定了谷棒莽草酸途径的7个酶以及分支酸异构酶,完成了谷棒DAHP合酶、分支酸异构酶、脱氢奎尼酸脱水酶以及莽草酸激酶功能表征,揭示了DAHP合酶和分支酸异构酶相互作用机理和调控关系。获得了3 549个莽草酸途径相关基因序列,确定了516个合成目标基因,完成了这些基因密码子优化和基因序列重新设计,选取了37个脱氢奎尼酸脱水酶基因人工合成,构建标准元件库,并表征了它们的酶促动力学参数。构建并验证了快速高通量的筛选—优化—合成—表征莽草酸途径元件库的Pipeline。另外在调控元件库构建方面,构建了包括RBS、Promoter、Terminator以及Insulator等4类共226个元件的调控元件库,为莽草酸通路模块的优化和精细调控的奠定了基础。模块的组装和优化方面,构建了基于Ribo J Insulator的基因表达定量调控模型,合成了莽草酸本地途径酶元件和调控元件元件进行模块组装,并在底盘细胞谷氨酸棒杆菌中实现了表达,对最优配比进行了初步筛选,将莽草酸产量提高了7倍。     

r结核分枝杆菌PhoP／PhoR基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

为构建结核杆菌PhoPR双组分系统PhoP、PhoR基因的重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR并对其进行鉴定。采用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA为模版,利用PCR技术分别扩增PhoP、PhoR基因编码序列,先克隆于T—Vector pMD19（Simple）,再亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取所得的阳性克隆子获得重组表达质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,通过PCR及双酶切鉴定。结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA中扩增出的PhoP、PhoR基因与GenBank公布的序列一致,经过PCR及双酶切鉴定,表明PhoP、PhoR基因均成功插入了pMV361穿梭载体。由此可知,成功构建了重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,为进一步研究PhoPR双组分系统奠定了基础。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

一种嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的诱导表达与活性表征

从嗜酸普鲁兰芽孢杆菌基因组中扩增出普鲁兰酶基因Pul A,并将该基因连接到大肠杆菌表达载体p ET-28a中,构建了普鲁兰酶基因的诱导表达载体p ET-28a-Pul A。测序结果表明,普鲁兰酶基因Pul A长度为2766 bp,编码922个氨基酸。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,普鲁兰酶基因Pul A在IPTG诱导下获得表达,产生胞内蛋白。SDS-PAGE测定的分子量约为110 k D。细胞超声破碎液酶活为0.45 U/m L。该酶的最适温度为55℃,最适p H为5.0,金属离子对酶活性影响不显著,具有I型普鲁兰酶特性。此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有独特的耐酸性质,具备一定的工业化应用价值。     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的酶学性质

对蜡状芽孢杆菌Bc-05茵株的发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析所获得的纤溶酶进行性质研究.结果表明:经纤维蛋白平板法检测该酶有直接水解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用,最适作用温度37℃,最适pH=8.0,在pH=8.0条件下25℃和37℃放置24 h酶活力仍保持77.52%和78.96%,该酶体外对兔血凝块有明显的溶解作用;Ca2+,Mn2+离子对该酶具有激活作用,而Cu2+,Fe3+完全抑制其纤溶活性,PMSF,EDTA和DTT对该酶有抑制作用,说明活性中心含有二硫键、金属离子和丝氨酸;测其N端10个氨基酸序列为NH2-Val-Thr-Pro-Thr-Asn-Ala-Val-Asn-Thr-Gly,与其他生物来源的纤溶酶相比较没有同源性.     

单因子和正交设计法建立分枝杆菌多重PCR体系

为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重PCR方法,以分支杆菌属特异基因32kD,结核分枝杆菌种特异基因MTP40和结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110为目标基因,设计合成3对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株DNA为模板,通过对PCR反应体系中DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度5个因素的正交设计,以及PCR反应条件中各反应参数的优化,建立了鉴别分支杆菌的多重PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了验证。结果显示:该方法对结核分枝杆菌标准株H37Ra能扩增出506、396和984bp,对卡介苗(BCG)能扩增出506和984bp片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出506bp片段,对大肠杆菌等的扩增结果均为阴性。建立的多重PCR敏感度最低可检出6.6×10-6 ng。结论:该方法具有特异性高、敏感性好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。     

大肠杆菌莽草酸生物合成途径的基因操作

为了调查大肠杆菌中相关基因的遗传操作对莽草酸途径和莽草酸积累的影响,利用温度敏感型质粒敲除了大肠杆菌JM83染色体DNA上编码莽草酸激酶的aroL基因,获得了该基因缺陷株JDL02;同时从大肠杆菌JM83染色体中分别克隆了aroG、ppsA和tktA3个基因,构建了多个表达质粒导入JDL02,得到了一系列重组菌。摇瓶发酵显示aroG基因的作用最为明显,各重组菌莽草酸产量均有不同程度的提高;在等生物量情况下,JDL02/pTrc-aroG-tktA的莽草酸产量是JM83的18.35倍,其摇瓶产量为94.33 mg/L。     

异硫氰酸酯法固定化醇脱氢酶乳酸脱氢酶和辅酶Ⅰ

本文探索了一条较为简便、实用的制备异硫氰酸酯活性载体的新方法,研究了用异硫氰酸酯共价法固定化醇脱氨酶、乳酸脱氢酶和辅酶Ⅰ的条件,并对三者进行了共固定化。按本实验方法得到的固定化醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活力回收可达8.9%和11.9%,得到的固定化三元全酶系统的辅酶再生能力为相应游离酶系统的4倍。     

NADP-异柠檬酸脱氢酶的结构与功能

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)在三羧酸(TCA)循环中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,将NAD 或NADP 还原成NADH或NADPH.根据空间结构特点,NADP-依赖性IDH可分为同源二聚体IDH和单体IDH,它们对生物体的能量代谢、生物合成以及抗氧化胁迫起重要作用.当碳源贫乏时,NADP-依赖性IDH的可逆磷酸化对TCA循环和乙醛酸旁路碳通量(carbon flux)的分配起关键性调控作用.因此目前IDH是研究蛋白质的结构与功能关系、酶的催化与调节机制、蛋白质功能进化的最好模型之一.     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化

报道了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化. 在0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液中,以溶胀法从酵母中提取胞内酶.粗抽提液经过60 %～75 % 饱和度的硫酸铵盐析, Sephadex G-100凝胶柱层析.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的收得率为12.4%,纯化倍数达51.2.     

酵母醇脱氢酶的分离纯化

报道了酵母醇脱氢酶的分离纯化，使用硫酸铵分级沉淀，SephadexG—100凝胶层析技术，从啤酒酵母提取液中分离出醇脱氢酶，收得率为10．9％，纯化倍数达53．2。     

谷氨酸脱氢酶(GDH)的性质

考察了GDH催化的最适条件:40℃,pH8.5,磷酸盐缓冲液离子强度为0.25mol/L.酶活性稳定的pH范围为5.5～9.0.甘油对GDH的热变性有明显的保护作用.     

意蜂苹果酸脱氢酶同工酶的电泳表型和基因型

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定了意蜂不同级别和不同发育阶段的苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶。意蜂的MDH有3个区带,其中MDHⅡ由3个等位基因编码,雌性峰是双倍体,有6种电泳表型,纯合子和杂合子各3种。雄性蜂是单倍体,有3种电泳表型。雌蜂和雄雌的幼虫与其成虫的酶谱相同。蛹期有1～2条附加带,卵期测不出MDHⅡ的活性。     

乳酸脱氢酶的稳定剂研究

研究了13种试剂(试剂组合)对乳酸脱氢酶冻干及存放稳定性的影响。发现稳定剂的结构规律是多羟基和多羧基化合物的合理组合。     

不同去垢剂对琥珀酸脱氢酶溶膜效果的比较研究

比较了3种溶膜剂Triton X-100、Tween-20和脱氧胆酸钠对琥珀酸脱氢酶（SDH）的溶膜效果。其中Triron X-100的效果为最好。并且，在1％的Triton X-100溶液中SDH能够较长时间保持活力。