套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒（WSSV）

解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织,制备成不同释放倍数的模板,对其进行白斑症病毒（WSSV）的PCR扩增,结果显示所建立的套式PCR的灵敏度大约为一步PCR的10^4倍;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行PCR检测,发现感染早期经一步PCR检测为WSSV阴性的样品,套式PCR的检测结果为阳性;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行PCR检测,发现经一步PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主,套式PCR的检测结果为阳性。表明所建立的WSSV套式PCR检测法较普通的一步PCR有更大的应用价值和意义。     

对虾疫病病毒的实验室常规检测方法

对虾疫病病毒的快速检出，是防治暴发性流行病的关键所在。本文简述了利用电镜负染技术，电镜超薄切片技术和聚合酶链反应邓ＰＣＲ技术等检测对虾疫病的具体方法，并且对结果进行了讨论。     

中国对虾（Penaeus chinensis）的白点综合征病毒（WSSV）的提？…

作者从发生白点综合征的中国对虾中，提取了一株白点综合征病毒，用电镜对纯化的病毒进行了形态学观察，并对病毒纯化过程中蛋白酶抑制剂的使用及离心速度的选择进行了探讨。经蔗糖密度梯度离心，分取各带负染后电镜观察，病毒条带位于４０％￣５０％蔗糖梯度之间，其完整毒粒长２２５￣２７０ｎｍ，直径７５￣８８ｎｍ，有的完整毒粒带有很长的尾，病毒衣壳长２５０￣３２０ｎｍ，直径６０￣８０ｎｍ。在匀浆使用的缓冲液中加入蛋白     

对虾白斑病毒PCR反应体系的改进

采用 TN匀浆 ,蛋白酶 K、DS消化、裂解 ,煮沸的方法 ,从感染白斑病毒的养殖对虾中提取 DNA作模板 ,在模板和扩增缓冲液用量恒定下 ,改变 PCR反应体系的 d NTP、引物和 Taq酶用量 ,进行 PCR扩增 ,使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果表明 ,d NTP用量在 1 2 5～ 1 87μM· L- 1、引物用量在 0 .6 μM·L- 1 、Taq酶用量达到 0 .5 u及以上时 ,扩增条带荧光很强 ,而使用产品提供商建议用量 ,PCR可现特异性扩增 ,但不是最佳的扩增     

PCR检测伪狂犬病病毒的研究

用ＰＣＲ的方法，扩增了伪狂犬病病毒ｇｐ５０基因的一段较为保守区。检测了不同ＰＲＶ毒株感染的ＢＨＫ细胞以及接种的家兔，并对ＰＣＲ检测的灵敏性作了初步研究。结果表明，ＰＣＲ法扩增ｇｐ５０基因具有较高特异怀和灵敏性，是检测ＰＲＶ的有效方法。     

PCR法检测小鼠自身携带的细小病毒

小鼠是 2种细小病毒ＭＰＶ和ＭＶＭ的终宿生。它们均可感染淋巴细胞 ,抑制体内肿瘤形成 ,污染细胞培养。由于细小病毒感染会干扰研究结果 ,因此确定小鼠感染ＭＰＶ还是ＭＶＭ是很重要的。本研究的目的是建立检测排泄物中病毒的ＰＣＲ方法 ,在血清抗体产生之前能够活体检测出ＭＶＭ和ＭＰＶ。排泄物中ＤＮＡ的提取最好用商品化的过柱方法 ,通过增加洗涤步骤帮助去除排泄物中的抑制物。为了提高敏感性 ,比较了4 5个循环扩增排泄物ＰＣＲ和只有 35个循环的组织ＰＣＲ。通过检测 37只来自同一群自然感染ＭＶＭ和ＭＰＶ成年Ｓｅｎｃａｒ小鼠的粪…     

B病毒PCR检测方法的建立

目的建立B病毒核酸的PCR检测方法。方法设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性。结果引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的片段出现,在以其他病毒为模板时无目的片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒I型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bp的两个片段,HSVI无变化。结论通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI。     

破译对虾病毒遗传密码

国家海洋局第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室在中国工程院院士徐洵教授的领导下,经过几年的不懈努力和刻苦攻关,终于成功地测定了造成多年来虾病爆发与流行的"罪魁祸首"--对虾白斑杆状病毒(WSBV)基因组的全部序列,从而在世界上率先破译了虾病病毒的遗传密码,而国际同行仅完成了对虾病毒1%的测序工作.这不仅标志着我国基因组研究从人到动物、到农作物之后,又向海洋生物延伸,而且为防治虾病和发展对虾养殖业奠定了分子生物学基础.     

对虾桃拉病毒(TSV)RT-PCR快速诊断技术的研究

对虾桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)最早于1992年在凡纳对虾(Penaeus vannamei)体内发现，此病毒是对虾养殖业危害较严重的病毒之一．将该病毒基因组的一段序列克隆至转录载体pSP64(PolyA)上。经体外转录、磁珠法分离、纯化获得了人工的TSV-RNA模板；用定量的TSV-RNA阳性对照模板进行RT-PCR条件优化。灵敏度检测以及样品制备方法等试验，结果表明：RT-PCR检测的灵敏度可达到0．1fg，相当于100个病毒粒子；所制备的样品对病毒RNA的逆转录及扩增无抑制，适合于对虾桃拉病毒快速检测．     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

对虾白斑症病毒的分离纯化及形态结构观察

取患白斑症的濒死斑节对虾 (Penaeusmonodon)的表皮、鳃和胃 ,匀浆后通过蔗糖密度梯度离心和蔗糖垫层差速离心两种方案 ,提纯出WSSV ;两种方案比较 ,蔗糖垫层差速离心操作简便 ,不需使用超速离心机 ,所得病毒纯度较高 ,损失少 .负染观察发现 ,纯化的病毒核衣壳 2个末端结构不同 ,其中一端呈圆形 ,高约 2 1nm ,另一端较平 ,高约 15nm ;完整核衣壳的两个末端结构间的螺旋单位一般为 15圈 ,但也偶见个别较长的核衣壳 ,其螺旋单位数达 2 3圈 .     

对虾白斑症病毒(WSSV)对蟹类的感染

在对虾白斑症病毒(WSSV)病发生期间,养殖虾池内的蟹类也往往出现异常甚至死亡．通过WSSV对三疣梭子蟹(Portumus trituberculatus)的人工感染证实了其感染性．三疣梭子蟹在注射感染后第9天全部死亡,注射后第6天死亡率最高;经口感染,三疣梭子蟹在感染后第25天全部死亡,在15～20d死亡率最高;在浸洗感染和对照组30d内无蟹子死亡．在感染死亡蟹子和发病虾池内病蟹的鳃、上皮组织的细胞核内电镜观察到的病毒粒子,其形态特征与在对虾上观察到的一样．用PCR和单克隆抗体的FAT法在注射感染和投喂感染的蟹子都得到了WSSV感染阳性结果,浸浴感染的蟹子和健康蟹子都得到了WSSV感染阴性结果．蟹类(三疣梭子蟹)对WSSV的敏感性较对虾低,为此蟹类有可能是WSSV的携带者或传播者．     

对虾白斑综合症病毒的概述

白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV),已在全球范围内成为对虾养殖业中最普遍、分布最广、最致命的病毒.但目前仍没有一种有效可行的措施来控制该病毒的发生和扩散.自1993年发现该病毒至今,国内外学者对对虾白斑综合症病毒的认识也越来越全面深入,取得了一些突破性的进展.本文全面综述了近年来对对虾白斑综合症病毒的认识和研究进展.这些信息将会拓展我们的认知,可能有助于发展有效的预防策略或治疗措施.     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组细菌双杂交系统的构建

细菌双杂交系统是新近建立的一种研究蛋白质间相互作用的方法.应用细菌双杂交系统,分别以pBT、pTRG诱饵质粒构建编码WSSV基因组DNA随机片段的融合表达质粒pBT-wssv、pTRG-wssv.重组质粒共转化双杂交报告菌株XLl-Blue MRF′,通过LB-TCK平板筛选对虾白斑综合征病毒中有相互作用的蛋白质.本研究中我们构建了WSSV基因组细菌双杂交系统,用于筛选WSSV中有相互作用的蛋白,为该病毒功能基因组的研究打下良好的基础.     

白斑综合症病毒对斑节对虾幼体和仔虾的致病性

斑节对虾(Penaeus monodon)的蚤状幼体和糠虾幼体经人工感染WSSV后,部分幼体的发育变态受到影响,其死亡率略高于对照组,但PCR二步法检测的结果为WSSV阴性．仔虾经人工感染WSSV后,部分个体的游动方式异常,感染60h后的死亡率达100％,样品经PCR二步法检测呈WSSV阳性．     

斑节对虾白斑综合症杆状病毒（WSSV）感染的组织特异性

应用光镜和电镜研究斑节对虾白斑综合症杆状病毒（ＷＳＳＶ）感染的组织特异性,结果证实ＷＳＳＶ组织特异性差,感染外胚层和中胚层来源的各种组织细胞的细胞核,如甲壳表皮细胞、鳃上皮细胞、神经细胞、造血组织细胞、胃上皮细胞、心肌细胞及其随体细胞、触角腺上皮细胞、胃和消化管的肌细胞和结缔组织细胞等,以甲壳表皮细胞、胃上皮细胞、结缔组织细胞和造血组织细胞最为显,细胞解体坏死。电镜观察对虾中肠和肝胰细胞未发现病     

对虾白斑综合症病毒P9蛋白转录水平的微阵列分析及其免疫荧光标记

从构建的对虾白斑综合症病毒cDNA文库中,我们筛选到一个拷贝数最高,编码82个氨基酸的基因(命名为p9,wsv230).该基因被克隆到pGEX-2T载体中进行GST融合蛋白的原核表达,纯化的融合蛋白GST-P9用于制备特异的多克隆抗体.利用微阵列技术和免疫荧光标记技术,对该蛋白的转录水平及其在感染细胞内的分布进行了初步研究,表明该基因为高丰度表达,推测是对虾白斑综合症病毒的一个重要基因.     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白质VP41的研究

VP41蛋白质是对虾白斑综合症病毒的一种结构蛋白,该蛋白质由病毒基因组上的wsv242开放阅读框(ORF)所编码,分子量为41 ku.根据vp41基因的序列,通过PCR扩增获得了该全长基因,将其克隆在载体pET-His上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了含His标记的目的蛋白VP41,并制备了特异性鼠抗血清.当纯化的病毒粒子经去污剂处理后,VP41蛋白质被发现完全存在于病毒WSSV囊膜部分,Western blot杂交实验也证实该结果,表明VP41蛋白质是该病毒的一个囊膜蛋白质.通过Far-Western方法还发现VP41具有蛋白聚合作用.     

对虾白斑综合征病毒非结构蛋白ICP11的研究

白斑综合征病毒(WSSV)是一种对虾养殖业中危险极大的传染性病原体,它是一种双链环状DNA杆状型病毒.ICP11是WSSV感染宿主后产生的一种高丰度表达蛋白,根据icp11基因的序列,通过PCR扩增获得了该全长基因,将其克隆在载体pET-His上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了含His标记的目的蛋白,并制备了特异性鼠抗血清.Western blot杂交实验结果显示,该蛋白不存在于纯化的病毒粒子的结构蛋白中,只存在于病毒感染的虾中肠组织的总蛋白中.这说明ICP11是WSSV的一种非结构蛋白.通过Far-western blot杂交分析,发现重组表达的ICP11会发生自身蛋白的聚合作用.凝胶过滤色谱层析法进一步证实ICP11蛋白可以聚合为二聚体.