实时荧光PCR方法检测含麸质的谷类产品管家基因

采用实时荧光PCR方法鉴别含麸质的谷类成分,选择大麦Hordein管家基因、小麦Gliadin管家基因、黑麦Sec1管家基因和燕麦Avenin管家基因作为物种鉴定的特异性标记基因,设计适合于Taqman探针实时荧光PCR扩增的引物和探针,从而达到鉴别检测食品中含麸质的谷类大麦、小麦、黑麦、燕麦成分的目的.特异性实验结果表明,分别采用大麦、小麦、黑麦、燕麦的引物和探针进行实时PCR扩增时,经检测25种样品,只有相对应的阳性物种样品产生荧光信号,其余非该物种样品均不产生荧光信号,表现出了很高的物种鉴定特异性.以大麦为例的灵敏性实验结果表明,原料样品检测灵敏性可达到0.01%,加工后的食品则可达到0.05%,符合食品成分痕量检测要求.     

小麦条锈菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了研究青海省小麦条锈菌在小麦潜育期叶片菌源量,文中以小麦条锈菌延伸因子EF1为引物,利用实时荧光定量PCR技术建立了小麦条锈菌潜育期菌源量检测体系。结果表明:(1)小麦条锈菌延伸因子EF1引物能从小麦叶片gDNA中扩增出特异性目的片段243 bp。(2)实时荧光定量PCR检测体系的灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍。(3)铭贤169叶片接种小麦条锈菌后第1天到第8天均检测到条锈菌,且菌源量随着天数的变化呈指数型增长趋势。本研究建立的检测体系可检测到小麦条锈菌在小麦潜育期叶片菌源量,为早期小麦条锈病的发生和防治提供理论依据。     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

转基因大豆和玉米加工产品的双重精确定量PCR检测方法

在很多国家,转基因生物(GMOs)及其衍生产品必须标有精确的转基因含量.最近研究中,实时定量PCR技术广泛应用于转基因成分的检测.然而,转基因生物的实时定量PCR方法的精确度仍然是一个难以解决的问题,尤其是对于高温处理过的样品.为了更好地准确定量高温处理样品中转基因的含量,对普通的实时定量PCR体系做了一些改进,包括重新设计内源基因和外源基因的引物,使得扩增较短并且大小接近的目标DNA片段,同时引物的GC含量和溶解温度也都相近.此外,采用热处理加工模型(HTPM)的方法,制备了含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品,并验证了改进后的实时定量PCR系统.实验结果表明:使用改进后的实时定量PCR体系测定热处理过的样品,发现其中的转基因含量的定量偏差明显降低.同时使用改进的双重实时定量PCR进一步验证转基因大豆的加工食品,结果也显示,转基因含量的定量结果更准确.这些结果表明:改进的双重实时定量PCR将适用于热加工产品的定量检测.     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用

荧光定量PCR技术是一种核酸定量技术,该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,因此在动物病毒病的检测中,荧光定量PCR技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点.     

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2~(-△Ct)×100%计算Elf-1基因表达水平.结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01).结论:建立SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况.     

对流实时荧光定量PCR系统设计

设计了一种结合实时荧光定量技术和自然对流技术的PCR系统.主要介绍该系统的双通道荧光激发与检测结构及其工作原理,系统中使用光纤作为光路的传输媒介,采用电荷耦合元件(CCD)工业相机采集荧光信号变化,并自行设计电路和软件驱动整套系统正常运行.最后通过对梯度稀释的巨细胞病毒(CMV)的基因模板进行扩增,展示了该系统可用于快速扩增和实时定量检测的潜力.     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.