人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

重组人甲状旁腺素1-34在毕赤酵母克隆及表达的研究

人甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的直链肽,含84个氨基酸,是维持体内钙磷平衡的主要激素。PTH通过识别骨骼、小肠和肾脏等细胞表面特异性受体,与降钙素和维生素D共同调节Ca2+,PO43-的代谢,具有明显的成骨作用。研究发现,PTH的N-端34肽(PTH 1-34)具有完全的PTH受体结合能力与生物活性。目前PTH 1-34作为临床治疗骨质疏松症的注射剂已在美国上市,但价格昂贵且需要每天注射给药。而国内关于PTH1-34的临床研究很少,所以有必要通过基因工程手段获取PTH 1-34,降低成本并可大规模制备目的蛋白。本文概述了PTH近年来在国内外的研究情况,利用目前发展较快的毕赤酵母真核表达系统,构建了高效表达PTH 1-34毕赤酵母工程菌。为今后上发酵罐摸清条件。     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定

人Elp3蛋白(human Elongator protein 3,hElp3)是组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸,其功能异常与人类多种疾病相关.目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少.以pYES2hElp3质粒为模板,PCR获hElp3基因全长,插入改造的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母菌GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析和G418筛选得到Mut+型多拷贝整合菌.0.5%的甲醇诱导hElp3高效分泌表达,Ni-NTA纯化及Western印迹证实获目的蛋白.OPA法测得其拥有良好的HAT活性,为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础,对筛选抑制其HAT活性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要.     

牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

山蛭素（haemadin）在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115-H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100 mg/L。摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3 kD和10 kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40 mg/L,回收率为40%。通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性：其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10^-13 mol/L。     

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZα-A 载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM,转化宿主菌Pichia pastoris X-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.     

重组人甲状旁腺素(rhPTH(1-84))的原核表达及发酵条件初步优化

 甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)是治疗骨质疏松症的药物之一.将人工合成全长人PTH(hPTH(1-84))的核苷酸序列插入pThioHis A载体中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli.),在IPTG的诱导下,成功实现了rhPTH(1-84)的原核表达.通过发酵条件的优化,初步确定1:40接种LB+30%M9盐溶液的发酵培养基,37℃培养至OD600 nm=0.8时,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,诱导8 h的较优发酵程序.     

植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

谷胱甘肽S-转移酶zeta类(GSTZ)是一种重要的多功能酶,与细胞生化代谢、环境净化等密切相关.将拟南芥、甘蓝型油菜"陕2B"和"垦C1"的GSTZ基因重组到表达载体pPIC9,电转化到毕赤酵母株GS115中,得到了分泌表达GSTZ酶的毕赤酵母工程菌株.甲醇诱导表达显示,最佳诱导时间在48～60 h,DCA-DC比活力为83.21～115.31 U/mg,GSTZ分泌量为25.71～42.90 U/mL.研究结果表明,植物GSTZ基因在毕赤酵母中的表达是高效的,为大规模发酵生产GSTZ奠定了基础.     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。     

巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究。结果表明：将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35 g/L和5 g/L时,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大,但培养时间可减少4 h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为4.0对目标蛋白的表达最有利,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的70％,比原来增加了近30％;分离纯化过程,采用将强阳离子（SPFF）与弱阴离子（DEAE）交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,目标蛋白产量约为50 mg/L;将目标蛋白酶切后,质量酶活性为8.56×10-3 mol/(s•g)。     

重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的：在巴期德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽，方法：用SacI和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒，电打孔法导入毕赤酵母GS115后，在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子，然后根据甲醇利用快速型（Mut^ ）和甲醇利用缓慢型(Mut^s）菌株的不同生长特点，筛选出Mut^ 和Mut^s型转化子，用PCR法进一步鉴定阳性克隆，分别用甲醇诱导Mut^ 和Mut^s型转化子表达目的蛋白4d，取培养产物冻干浓缩，进行SDS-PAGE和Western blotting，筛选出能特异表达目的的蛋白的菌株，分析蛋白的含量及纯度。结果：重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达，其表达量约占培养上清分泌蛋白的76.5%，结论：重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达。     

胞内表达猪生长激素基因的重组酵母菌构建与鉴定

将猪生长激素(pGH)cDNA定向插入毕赤酵母胞内表达载体pPIC 3.5k质粒,重组构建了pPIC 3.5kpGH/GS115酵母表达系统, 其表达产物的SDSPAGE和Western blot结果表明, pGH蛋白在胞内获得正确表达,表达量达378 mg/L.     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

Hepc 20在毕赤酵母中的胞内表达及鉴定

构建了Hepc 20的毕赤酵母表达载体,在毕赤酵母中能成功表达有活性的Hepc 20。优化了菌株的培养诱导条件,结果表明BMMY培养基是Hepc 20表达和重组菌株生长的最佳培养基,甲醇诱导终体积分数0.5%,在此条件下Hepc 20在重组菌株中的表达量约为3.6 mg/L。Western blot检测显示的22000处的条带为重组Hepc 20条带;ELISA验证表明重组Hepc 20可以跟抗体特异结合,琼脂扩散法抗菌实验表明重组Hepc 20对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。