拟南芥膜蛋白GPX3的原核表达及纯化

本文从哥伦比亚生态型的拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia 0)中克隆了谷胱甘肽过氧化物酶AtGPX3的完整编码序列(Coding sequence,CDS)以及部分片段的CDS序列,构建了该基因的不同区域的表达载体,在Transetta(DE3)的BL21大肠杆菌中表达,并成功纯化了GPX3膜蛋白,不仅为后续实验研究GPX3的结构与功能提供了材料,而且为研究膜蛋白表达与纯化的方法提供了借鉴.     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

人源雄激素受体DNA结合结构域的原核表达与其响应元件的复合物结晶

为获得高分辨率的雄激素受体与其响应元件的复合物晶体结构,为前列腺癌的治疗提供药物靶点设计的理论基础.本研究构建了AR-DBD的原核表达载体,在0.5 mmol/L IPTG,16℃条件下诱导24 h表达该蛋白.通过与AR响应元件寡核酸的结合优化蛋白纯化条件,使AR-DBD蛋白易于纯化.最终,蛋白核酸复合物晶体呈现出边缘清晰,短棒状的立体结构,本研究制备的蛋白核酸复合物晶体可直接用于X射线衍射分析.     

hPin1原核表达、纯化及热稳定性研究

利用E．coli BL21原核表达,纯化得到了His-hPin1融合蛋白,并研究了它的热稳定性．在中性条件下进行不同温度处理,SDS-PAGE分析表明,低于40℃处理不会影响His-hPin1的溶解性,50～100℃处理会使其部分变性而沉淀．荧光发射光谱研究表明,未处理的His-hPin1具有339nm的荧光发射峰;热处理使荧光发射峰的位置变化,低于40℃处理对His—hPin1的荧光强度影响较小,50～100℃热处理使HiS-hPin1的荧光强度明显降低．圆二色谱研究表明,热处理对His-hPin1的二级结构有影响,引起α-螺旋含量的明显减少,而无规卷曲增加．以上数据表明hPin1是一个相对热稳定的蛋白．     

抗菌肽AP-57的原核表达与纯化

构建AP-57/C10orf99 重组表达载体,并在BL21中进行重组蛋白的表达,经纯化获得高纯度的AP-57,从而为其功能性研究提供基础。通过合成AP-57基因序列,连接入pET32质粒中与Trx标签和His标签融合,转化进DH5α,经筛选、鉴定为阳性克隆菌落中提取的粒转入基因工程化BL21中进行表达。通过优化表达条件如温度、诱导时间和诱导剂(IPTG)浓度来提高重组蛋白表达量;最后,通过亲和层析浓缩获得融合蛋白,去标签和阳离子交换层析、脱盐步骤获得纯的AP-57蛋白。结果是成功构建了AP-57的诱导表达和纯化体系：当菌液OD为0.6-0.8时,用0.5 mmol/LIPTG,25℃,诱导培养6 h;通过纯化后获得的样品经质谱和SDS-PAGE鉴定为AP-57且含一个链内二硫键。本实验建立了一条完整的AP-57制备工艺,为后续其功能性研究奠定了基础。     

贻贝蛋白Mgfp-5的原核表达与纯化

贻贝(Mytilus galloprovincialis)足丝中黏附蛋白,是一种黏合强度高、生物相容性好、优质的生物黏合剂,可以应用于医学、表面化学、海洋工程等领域,其中富含DOPA(多巴,3,4-二羟基苯丙氨酸)的贻贝足丝蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5,Mgfp-5)显著表现出此特性。天然获取Mgfp-5含量低,易固化,纯化困难,越来越多学者尝试基因工程获得黏蛋白。文中构建重组质粒p ET28a-mgfp,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白Mgfp-5。为得到高质量的Mgfp-5蛋白,优化了Mgfp-5蛋白诱导表达参数:菌液OD_(600)=0.8,诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷(IPTG)0.8 mmol/L,37℃,诱导8h;优化镍离子亲和层析纯化蛋白Mgfp-5最佳条件为:Elution Buffer的p H为7.0,500 mmol/L咪唑。Western Blot鉴定到重组Mgfp-5可以特异性表达。该研究为得到大量Mgfp-5蛋白奠定了基础,为加速黏蛋白的黏附机理及生物医学黏合剂的开发提供参考。     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化.结果显示,可溶性部分以及经2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为150mM.纯化后重组蛋白的纯度在90%以上.     

VPAHPND毒力蛋白PirAB的原核表达与纯化

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是一种新型对虾病害,其病原为一类携带编码二元毒素蛋白PirAB的弧菌(VP_AHPND),可感染对虾且致死率高。本研究利用GenBank公布的pirAB全基因序列设计特异性引物,通过PCR获得目的基因pirA、pirB、pirAB并克隆至表达载体pET 21b(+)中,构建BL21-pET21b-pirA、BL21-pET21b-pirB、BL21-pET21b-pirAB原核表达体系;通过对诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,分析重组蛋白的最佳表达条件;采用Ni磁珠对重组蛋白进行纯化,并以Western-blot方法分析其抗原性。结果表明,PirA、PirB、PirAB的重组蛋白分子质量分别约为17 kDa、50 kDa和(50+17) kDa,与预期大小一致。重组蛋白的最佳诱导条件：IPTG浓度0.01 mmol/L,PirA和PirAB 30℃诱导24 h、PirB 30℃诱导4 h,蛋白均呈现可溶性表达;纯化后的重组蛋白具有较好的反应原性,可为下一步的抗体制备和AHPND致病机理研究提供充足的实验材料。     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

麻疯树脱氢抗坏血酸还原酶基因克隆及重组蛋白纯化

利用RACE技术克隆出麻疯树脱氢抗坏血酸基因JcDHAR,构建原核表达载体pET-28a-JcDHAR,并对重组菌表达的条件进行了优化,进而进行Ni亲和层析纯化蛋白.结果表明:表达产物与预期大小相符,His-JcDHAR蛋白质的分子质量为30kD;在37℃的条件下0.1mM的IPTG诱导表达5h时,获得了可溶性重组蛋白,通过体外酶学反应鉴定,纯化样品具有酶学活性,表明JcDHAR原核表达成功.     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。